DNA定序- 維基百科，自由的百科全書

DNA定序可用於確定任何生物的單個基因的序列，較大的遺傳區域（即基因簇或操縱子的簇），完整的染色體或整個基因組。

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DNA定序（英語：DNAsequencing）又稱DNA測序，是指分析特定DNA片段的鹼基序列，也就是腺嘌呤（A）、胸腺嘧啶（T）、胞嘧啶（C）與鳥嘌呤（G）的排列方式。

快速的DNA定序方法的出現極大地推動了生物學和醫學的研究和發現。

在基礎生物學研究中，和在眾多的應用領域，如診斷，生物技術，法醫生物學，生物系統學中，DNA序列知識已成為不可缺少的知識。

具有現代的DNA定序技術的快速定序速度已經有助於達到定序完整的DNA序列，或多種類型的基因組定序和生命物種，包括人類基因組和其他許多動物，植物和微生物物種的完整DNA序列。

RNA定序則通常將RNA提取後，反轉錄為DNA後使用DNA定序的方法進行定序。

目前應用最廣泛的是由弗雷德里克·桑格發明的桑格定序[1]。

新的定序方法，例如454生物科學的方法和焦磷酸定序法。

自動化chain-terminationDNA定序結果的一個例子。

目次 1應用 1.1分子生物學 1.2演化生物學 1.3宏基因組學（或元基因組學） 1.4醫學 1.5法醫學 2歷史 2.1DNA結構與功能的發現 2.2RNA測序 2.3全基因組測序 3基本方法 3.1Maxam-Gilbert測序法 3.2Sanger測序法 4高級方法和denovo測序法 4.1霰彈槍定序法 4.2BridgePCR 5新一代測序 5.1454生物科學和焦磷酸測序法 6正在開發的測序法 6.1奈米孔DNA測序法 6.2高通量測序 7參見 8參考文獻 應用[編輯] DNA定序可用於確定任何生物的單個基因的序列，較大的遺傳區域（即基因簇或操縱子的簇），完整的染色體或整個基因組。

DNA定序也是對RNA或蛋白質進行定序的最有效方法（通過對開放閱讀框定序）。

目前，DNA定序已成為生物學和其他科學領域（如醫學，法醫學或人類學等）的關鍵技術。

分子生物學[編輯] 在分子生物學中，DNA定序可被用於研究基因組及其編碼的蛋白質。

利用定序獲得的資訊，科研人員能夠辨識基因的變化，基因與疾病和表型的關聯，並確定潛在的藥物靶點。

演化生物學[編輯] 由於DNA是攜帶有遺傳資訊的大分子，在演化生物學中，DNA定序被用於研究不同生物體之間的相關性以及它們是如何演化的。

宏基因組學（或元基因組學）[編輯] 主條目：元基因組學 宏基因組學是一門直接取得環境中所有遺傳物質的研究。

環境包括但不限於水體，污水，污垢，從空氣中過濾出的碎片或者從生物體採集的樣本。

了解在特定環境中存在哪些生物體對於生態學，流行病學，微生物學和其他領域的研究至關重要。

DNA定序使研究人員能夠確定微生物群中可能存在哪些類型的微生物。

醫學[編輯] 醫療人員可通過對患者基因（基因組）的定序結果確定該患者是否有攜帶遺傳性疾病的風險。

需要注意的是，該方法屬於基因檢測，有些基因檢測不會用到DNA定序技術。

法醫學[編輯] DNA定序可以與DNA圖譜鑑定（基因指紋分析，英語：DNAprofiling）一起用於法醫鑑定和親子鑑定。

DNA測試在過去的幾十年中發展迅猛，目前已能夠做到將DNA鑑定結果與被調查物件聯絡起來。

指紋，唾液，毛囊等中的DNA特徵可以將不同的生物體進行區分。

測試DNA是一種可以檢測DNA鏈中特定基因組並生成唯一的個性化DNA模型的技術。

每一種有機體都有其DNA特徵，並可以通過DNA測試來確定。

兩個人具有完全相同的DNA特徵是非常罕見的，因此保證了DNA測試的成功。

歷史[編輯] DNA結構與功能的發現[編輯] 弗雷德里克·桑格，DNA定序的先驅者。

桑格是少數獲得兩項諾貝爾獎的科學家之一，其中一項為蛋白質定序，另一項為DNA定序。

去氧核糖核酸（DNA）最早在1869年由FriedrichMiescher發現並分離出來，但由於當時普遍認為遺傳資訊儲存於蛋白質而不是DNA中，因此在過去幾十年中DNA一直沒有得到充分研究。

1944年，由於OswaldAvery，ColinMacLeod和MaclynMcCarty的一些實驗表明，純化的DNA可以將一種細菌變成另一種細菌，這種情況才發生了變化。

這也是首次DNA顯示出改變細胞特性的能力。

1953年，JamesWatson和FrancisCrick根據RosalindFranklin研究的結晶X射線結構提出了他們的雙螺旋DNA模型。

根據該模型，DNA由彼此纏繞的兩條核苷酸鏈組成，通過氫鍵連接在一起並以相反方向執行。

每條鏈由四個互補的核苷酸組成：腺嘌呤（A），胞嘧啶（C），鳥嘌呤（G）和胸腺嘧啶（T），其中A與T配對，C與G配對。

他們提出的這種結構，使得每條單鏈都可被用於重建另一條鏈，並且讓遺傳資訊代代相傳。

對蛋白質進行定序的基礎首先由弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）的工作奠定，他於1955年完成了胰島素（胰腺分泌的一種蛋白質）中所有胺基酸序列的定序工作。

這是首個確鑿的證據證明蛋白質是具有特定分子模式的化學實體，而不是懸浮在流體中的隨機混合物。

桑格在胰島素定序方面的成功使得X射線晶體學家大為振奮，包括華生和克里克，他們現在正試圖理解DNA如何指導細胞內蛋白質的形成。

在1954年10月弗雷德里克·桑格出席一系列講座後不久，克里克開始發展一種理論，認為DNA中核苷酸的排列決定了蛋白質中胺基酸的序列，從而幫助確定蛋白質的功能。

他於1958年發表了這一理論。

RNA定序[編輯] RNA定序是最早的核苷酸定序形式之一。

RNA定序的主要標誌是1972年和1976年WalterFiers及其同事在根特大學（根特，比利時）確定並發表的第一個完整基因序列和噬菌體MS2的完整基因組。

傳統的RNA定序方法需要建立一個用於定序的互補cDNA（ComplementaryDNA）分子。

全基因組定序[編輯] 第一個完整的DNA基因組定序是在1977年噬菌體φX174的定序工作。

醫學研究委員會的科學家在1984年破譯了Epstein-Barr病毒的完整DNA序列，發現它含有172,282個核苷酸。

該序列的完成標誌著DNA定序的一個重要轉折點，它在沒有病毒基因譜知識的情況下實現了DNA定序。

20世紀80年代初，Pohl及其同事開發了一種在電泳時將定序反應混合物的DNA分子轉移到固定基質上的非放射性方法。

隨後GATCBiotech公司的DNA定序儀「Direct-Blotting-Electrophoresis-SystemGATC1500」商業化，該定序儀在EU基因組定序程式的框架以及酵母釀酒酵母染色體II的完整DNA序列中廣泛使用。

加利福尼亞理工學院的LeroyE.Hood實驗室於1986年宣布了第一台半自動DNA定序機。

隨後，AppliedBiosystems在1987年推出了第一台全自動定序儀ABI370。

以及Dupont公司的Genesis2000，該儀器使用了一種新的螢光標記技術，可在單一泳道中辨識所有四個雙去氧核苷酸。

到1990年，美國國立衛生研究院（NIH）已開始對支原體，大腸桿菌，秀麗隱杆線蟲和釀酒酵母進行大規模定序實驗，費用為每個鹼基0.75美元。

同時，人類cDNA序列的定序始於CraigVenter的實驗室，試圖取得人類基因組的編碼部分。

1995年，Venter，HamiltonSmith及其基因組研究所（TIGR）的同事發表了第一個完整的自由生物體細菌流感嗜血桿菌（Haemophilusinfluenzae）的基因組。

該環形染色體中含有1,830,137個鹼基，其在《科學》雜誌中的發表標誌著全基因組鳥槍法定序的首次公開使用，擺脫了初始繪製工作的需要。

基本方法[編輯] Maxam-Gilbert定序法[編輯] 主條目：馬克薩姆-吉爾伯特定序 馬克薩姆-吉爾伯特定序（英語：Maxam-Gilbertsequencing）是一項由阿倫·馬克薩姆（英語：AllanMaxam）與沃爾特·吉爾伯特於1976～1977年間開發的DNA定序方法。

此項方法基於：對核鹼基特異性地進行局部化學改性，接下來在改性核苷酸毗鄰的位點處DNA骨架發生斷裂[2]。

Sanger定序法[編輯] 主條目：桑格定序 Sanger（桑格）雙去氧鏈終止法是弗雷德里克·桑格（FrederickSanger）於1975年發明的。

定序過程需要先做一個聚合酶連鎖反應（PCR）。

PCR過程中，雙去氧核苷酸可能隨機地被加入到正在合成中的DNA片段里。

由於雙去氧核糖核苷酸又少了一個氧原子，一旦它被加入到DNA鏈上，這個DNA鏈就不能繼續增加長度。

最終的結果是獲得所有可能獲得的、不同長度的DNA片段。

目前最普遍最先進的方法，是將雙去氧核糖核苷酸進行不同螢光標記。

將PCR反應獲得的總DNA通過毛細管電泳分離，跑到最末端的DNA就可以在雷射的作用下發出螢光。

由於ddATP,ddGTP,ddCTP,ddTTP（4種雙去氧核糖核苷酸）螢光標記不同，電腦可以自動根據顏色判斷該位置上鹼基究竟是A，T，G，C中的哪一個[3]。

進階方法和denovo定序法[編輯] 霰彈槍定序法[編輯] 主條目：霰彈槍定序法 霰彈槍定序法（Shotgunsequencing，又稱鳥槍法）是一種廣泛使用的為較長DNA定序的方法。

它比傳統的定序法快速，但精確度較差。

霰彈槍定序法曾經使用於塞雷拉基因組（CeleraGenomics）公司所主持的人類基因組計劃。

BridgePCR[編輯] 此章節尚無任何內容。

(2021年2月3日) 新一代定序[編輯] 主條目：大規模並行定序（英語：Massiveparallelsequencing） 隨著人們對低成本定序的需求與日俱增，推動了高通量定序（high-throughputsequencing）的發展，此技術又稱為二代定序、新一代定序、次世代定序；這些技術對定序過程采多路復用，同時產生上千或上百萬條序列[4][5]。

高通量定序技術的目的是降低DNA定序的成本，這個成本比同樣可實現定序的染料終止法來得低得多[6]。

超高通量定序過程中可同時執行高達500,000次的邊合成邊定序[7][8][9]。

新世代技術利用電腦科技，需要根據多個片段序列所重疊的區域，將它們全部組裝起來。

新一代定序方法的比較[10][11] 方法 單分子即時定序（PacificBio） 離子半導體（IonTorrentsequencing） 焦磷酸定序（454） 邊合成邊定序（Illumina） 邊連接邊定序（SOLiDsequencing） 鏈終止法（Sangersequencing） 讀長 5,500bpto8,500bpavg(10,000bpN50);maximumreadlength>30,000bases[12][13][14] upto400bp 700bp 50to300bp 50+35or50+50bp 400to900bp 精確度 99.999%consensusaccuracy;87%single-readaccuracy[15] 98% 99.9% 98% 99.9% 99.9% 每次執行可取得讀段數 50,000perSMRTcell,or~400megabases[16][17] upto80million 1million upto3billion 1.2to1.4billion N/A 每次執行耗時 30minutesto2hours[18] 2hours 24hours 1to10days,dependinguponsequencerandspecifiedreadlength[19] 1to2weeks 20minutesto3hours 每百萬鹼基所耗成本（美元） $0.33-$1.00 $1 $10 $0.05to$0.15 $0.13 $2400 優勢 Longestreadlength.Fast.Detects4mC,5mC,6mA.[20] Lessexpensiveequipment.Fast. Longreadsize.Fast. Potentialforhighsequenceyield,dependinguponsequencermodelanddesiredapplication. Lowcostperbase. Longindividualreads.Usefulformanyapplications. 劣勢 Moderatethroughput.Equipmentcanbeveryexpensive. Homopolymererrors. Runsareexpensive.Homopolymererrors. Equipmentcanbeveryexpensive.RequireshighconcentrationsofDNA. Slowerthanothermethods.Haveissuesequencingpalindromicsequence.[21] Moreexpensiveandimpracticalforlargersequencingprojects. 454生物科學和焦磷酸定序法[編輯] 454定序法由454生物科學發明，是一個類似焦磷酸定序法的新方法。

2003年向GenBank提交了一個腺病毒全序列[22]，使得他們的技術成為Sanger定序法後第一個被用來測生物基因組全序列的新方法。

454使用類似於焦磷酸定序的方法，有著相當高的讀取速度，大約為5小時可以測兩千萬鹼基對[22]。

正在開發的定序法[編輯] 奈米孔DNA定序法[編輯] 主條目：奈米孔定序 高通量定序[編輯] 高通量定序能一次對幾十到幾百萬DNA分子進行序列測定。

參見[編輯] 分子與細胞生物學主題 已定序的生物 參考文獻[編輯] ^存档副本.[2006-11-17].（原始內容存檔於2006-11-11）.  ^MaxamAM,GilbertW.AnewmethodforsequencingDNA.Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.February1977,74(2):560–4.Bibcode:1977PNAS...74..560M.PMC 392330 .PMID 265521.doi:10.1073/pnas.74.2.560.  ^Sangersequencing.2020年3月20日[2020年3月27日].（原始內容存檔於2020年3月29日）–透過Wikipedia.  ^Hall,Nell.Advancedsequencingtechnologiesandtheirwiderimpactinmicrobiology.J.Exp.Biol.May2007,209(Pt9):1518–1525.PMID 17449817.doi:10.1242/jeb.001370.  ^Church,GeorgeM.Genomesforall.Sci.Am.January2006,294(1):46–54.PMID 16468433.doi:10.1038/scientificamerican0106-46.  ^參照錯誤：沒有為名為pmid18165802的參考文獻提供內容 ^Kalb,Gilbert;Moxley,Robert.MassivelyParallel,Optical,andNeuralComputingintheUnitedStates.IOSPress.1992.ISBN 90-5199-097-9. [頁碼請求] 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