『收藏篇』基因敲除技术 - 知乎专栏

其中，尤以Cre/Loxp 系统和FLP/FRT系统应用最为广泛。

... 也是位点特异的重组系统，其原理与Cre/LoxP 重组系统相似。

由FLP重组酶介导两个FRT位点之 ... 无障碍写文章登录/注册搜索并登录“维真生物”官网查看更多关于基因敲除技术详情！基因敲除分为完全基因敲除和条件型基因敲除两种。

1、完全基因敲除通过基因敲除技术完全消除细胞或者动物个体中的靶基因活性。

CRISPR/Cas9基因敲除技术CRISPR/Cas9系统由核酸酶Cas9和单链向导RNA(singleguideRNA,sgRNA)组成。

Cas9蛋白具有两个核酸酶结构域——RuvC样结构域和HNH结构域（RuvC结构域负责切割靶向链，而HNH负责切割与sgRNA互补配对的非靶向链），它可以在DNA的特定位置引入DSBs。

sgRNA来源于反式激活CRISPRRNA（tracrRNA）和CRISPRRNA（crRNA）。

每个crRNA包含一个保守的与tracrRNA互补的重复序列和一个与外源DNA互补的20nt的转录间隔区。

tracrRNA与crRNA互补后结合Cas9蛋白，形成CRISPR/Cas9-sgRNA复合物，在基因组的目标位点产生双链断裂。

图1.CRISPR/Cas9系统的结构成分（SunJetal.BriefFunctGenomics.2020;LiuCetal.JControlRelease.2017）TracrRNA/crRNA通常被设计成单链小片段的向导RNA—sgRNA。

sgRNA主要包含两个关键片段：3'端的双股RNA结构与Cas9蛋白结合，5'端的引导序列与目标DNA序列结合。

与TALENs相比，CRISPR/Cas9具有成本低、效率高和简单易用等优势，因而被人们广泛应用。

下表所列为TALENs和CRISPR/Cas9两种技术的比较：2、条件型基因敲除通过定位重组系统实现特定时间和空间的基因敲除。

其中，尤以Cre/Loxp系统和FLP/FRT系统应用最为广泛。

Cre/LoxP重组酶系统包含两个部分：Cre重组酶及其特异识别的LoxP位点。

Cre重组酶是一种位点特异性重组酶，可介导两个34bp的LoxP位点之间的特异性重组，使LoxP位点之间的序列或基因被删除或者倒转。

LoxP位点包括两个13bp的反向重复序列和一个8bp的间隔区域。

其中，反向重复序列是Cre重组酶的特异识别位点，而间隔区域决定了loxP位点的方向。

图2.Cre/LoxP系统（MclellanMAetal.CurrentProtocolsinMouseBiology,2017）Cre/LoxP重组系统诱导基因重组的方式主要有以下4种：①两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相同，Cre重组酶敲除loxP间的序列。

②两个loxP位点位于同一条DNA链上且方向相反，Cre重组酶诱导loxP间的序列翻转。

③两个loxP位点位于不同的DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导两条DNA链发生交换或染色体易位。

④四个loxP位点分别位于两条DNA链或染色体上，Cre重组酶诱导loxP间的序列互换。

图3.Cre/LoxP重组系统诱导基因重组的方式FLP/FRT重组酶系统也是位点特异的重组系统，其原理与Cre/LoxP重组系统相似。

由FLP重组酶介导两个FRT位点之间DNA序列的重组。

FLP重组酶的剪切只发生在相同序列的FRT之间，不同序列的FRT之间不发生重组。

FLP/FRT重组酶系统效率较Cre/LoxP重组系统低，其应用受到一定限制，常与其它系统联合使用，以实现较为复杂的多重表达载体的构建，或者是目的片段的剪切。

它莫西芬（tamoxifen）控制的重组酶系统由它莫西芬（Tamoxifen，一种雌激素受体分子药物）调节的重组酶（CreER和FlpER）是一种更加精准的诱导体系。

以CreER重组酶为例，Tamoxifen不给药时Cre-ER融合蛋白的ER部分与HSP90蛋白相互作用，阻止融合蛋白进入细胞核（图4A）。

Tamoxifen给药后，Tamoxifen分子干扰Cre与HSP90的相互作用，使Cre迁移到细胞核。

一旦进入细胞核，Cre重组酶就可以进行重组（图4B）。

图4.Cre-雌激素受体(ER)融合蛋白诱导Cre-loxP系统的工作原理（MclellanMAetal.CurrentProtocolsinMouseBiology,2017）发布于2021-08-1609:27crispr/cas9基因编辑基因工程​赞同22​​添加评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​