实验七利用FLP/FRT 重组系统获得纯合突变克隆，Mosaic杂交 ...

Video created by 北京大学for the course "遗传学实验". 介绍基因功能研究策略的背景知识，以被誉为果蝇遗传学家瑞士军刀的Gal4-UAS系统原理和灵活多样的使用为基础， ... ListFLPFRT重组系统与Mosaic杂交实验（2）Loading...遗传学实验北京大学免費註冊此課程視頻腳本本课程的实验设计贯穿以研究基因功能为目的遗传学思维理念及精髓。

通过背景知识的介绍和相关的实验操作，使大家建立这样的理念：研究基因功能时，在分子水平通过敲除或者敲入的策略，使基因突变或者修饰，这些突变依赖载体染色体的传递，将稳定地传给下一代。

通过设计精巧的遗传杂交实验，追踪易于识别的染色体标记，就可以定位目的基因、获得纯合突变体，研究表型与基因型间的对应关系，从而理解各种表型的分子机制。

整个实验过程涉及生物学不同学科知识和实验设计的融合。

针对遗传学研究的这些关键点，本课程设计了一系列实验，主要以模式动物果蝇为窗口，通过遗传杂交实验，以遗传信息传递的载体染色体为线索，除验证遗传学基本定律外，还引入科研项目的理念和实验环节，以便让大家参与平时在课堂上接触不到的真实科研实践。

每次实验包括背景原理、目的介绍、操作要点和相关的视频演示。

让学生亲自保管和观察杂交果蝇培养瓶，写生活史观察日记也是本课程的特色之一。

学生，尤其是高年级本科生和进入国内外科研第一线的研究生，均反馈受益非浅。

参考教材为由张文霞主编，高等教育出版社出版的《遗传学实验指导》。

此外相应的实验将提供参考文献。

MOOC实验课虽然无法亲自操作，但我们将提供丰富的图片和视频资料，使大家了解其过程。

有实验条件的选课人员，可以依照讲解和演示，亲自操作。

查看授課大綱從本節課中实验七利用FLP/FRT重组系统获得纯合突变克隆，Mosaic杂交实验介绍基因功能研究策略的背景知识，以被誉为果蝇遗传学家瑞士军刀的Gal4-UAS系统原理和灵活多样的使用为基础，说明如何通过遗传策略实现目的基因的敲除（敲低）或过表达。

转基因果蝇的构建流程和如何利用平衡染色体定位转基因发生在哪条染色体上；果蝇复眼和翅（作为基本问题研究的窗口）的特点介绍等。

具体实验：利用简单高效的FLP/FRT重组系统，通过遗传杂交获得纯合突变克隆，实现体内对纯合突变基因（包括致死基因）功能的研究。

FLPFRT重组系统与Mosaic杂交实验（1）34:34FLPFRT重组系统与Mosaic杂交实验（2）25:39子一代杂交及去亲本1:53教學方张文霞AssociateProfessorWenxiaZhang,PhD以免費的價格試聽課程好，回到我们上次给大家布置的这个思考题。

那么其实第一个思考题很简单，是吧？就是说如何让一个杂合的转基因果蝇给它纯合了？是吧？只要两个杂合体的果蝇杂交就可以达到纯合的是吧？但问题是，如果这个纯合以后的个体这个基因是致死的，怎么办？它都死掉了，你根本就没办法提取了好，我们在果蝇里边呢有办法来解决这个问题，我们用的是这个FLP/FRT这么一个重组系统，然后呢，用这样的重组系统我们就可以做出一个堪合的个体来你们看文献了吗？我们给大家提供的文献？如果大家是真正地是感兴趣这个基因功能的研究的话我提出这样的问题来，大家呢应该很迫切地去看，诶，究竟致死基因我怎么来研究呢？是不是？好，我们看一下，就是说如果人呢得了癌症了，也就是说某个基因突变了某个基因突变以后呢，他长了癌了以后呢实际上呢，在这个时候呢，就是说他某一片组织呢，是有问题的，是吧？但是呢，其他的区域呢都还是正常的，是不是？所以呢在这种情况下的话实际上呢是一个镶嵌的一个个体，对吧？呃经常在我们人里边的话，医院里边怎么做呢？把这个组织给它想办法取出来，然后呢做病例检测，是吧？在人里边的话，也最多能做到这一点不能做更深入地去遗传研究了，是不是？好，但是呢，如果我们在果蝇里边想办法也能做到，就是说在某个区域这个组织和细胞的那个分子呢，它是纯合突变的而身体的其他部分呢，都是正常的，在这种情况下的话，我们在果蝇里边的话即使这个基因是纯合致死的我们就在组织里边还可以去研究它，并不一定可以在个体里边去研究，是不是？好。

怎么做到的呢？那刚才我们提到的是什么？是在体细胞里边是吧？是在个体水平上来做这样的事，所以的话，在个体水平上这个细胞增殖的话，是应该是有丝分裂，是吧？好那么这个细胞有丝分裂的时候呢，大家可以看一下我们一个杂合的细胞，其中一条染色体上边带着突变体，也就是说这个红色的上边这个星号带着突变，另外一条染色体呢是正常的，好那么，它经过复制以后呢，在细胞分裂的中期的时候呢，我们可以看到的是每条同源染色体呢，复制以后呢，是有相同的染色单体，是吧？好，那么按照正常的有丝分裂的时候呢，形成的细胞，子细胞，其实呢，形成的两个子细胞的话应该是跟这个最开始的这个细胞是完全一样的是吧？没有任何区别的，对不对？但是呢，在这个时候呢，我们人为地引进这个重组系统，同源重组的这个系统也就是说，在这个同源染色体的两条臂上边呢，放一个同源重组的位点，FRT呢，是一个同源重组的位点然后呢，在这个重组酶，我们叫Flp重组酶的作用下，然后呢这个染色单体之间呢，就会发生重组好，你们可以看一下这个在染色体靠近着丝粒的位置呢，我们引入了FRT这样的位点然后呢，在转座酶Flp的作用下呢，在分裂以前呢这个这两条染色体上边的区域就会交换交换了以后，最后细胞分裂的时候呢，大家可以看，我们就可以形成两个细胞，一个细胞呢，是两个突变体，也就是纯合隐性纯合的，而另外一个细胞呢是野生型的，是吧？好，这样的话，经这两个细胞当然还有同样还有另外一个细胞是杂合的是吧？这个和这个跑到一个细胞里边，就形成一个杂合的细胞，是不是？好，实际上是三类细胞，对不对？这样的细胞，然后呢经过发育的话，这个细胞，本来原来是一个是吧？诶，经过发育的话，就是说这附近的这些细胞呢，全部都是隐性纯合的，在它旁边呢，正好是那个野生型的这个细胞。

好这样的话，我们就达到在体细胞里边让某一个基因纯合的目的了。

好这个FRT和FLP的这两个元件呢，实际上呢，最开始发现呢，是在酵母里边发现的好，那么我们同样把酵母里边的这两个元件做成两个不同的转基因果蝇好，如果需要它们重组的时候呢，然后呢，让两个果蝇然后呢，一杂交，就可以了。

那么这个杂交发生在什么区域呢？同样是取决于这个Flp，也就是说重组酶前边的那个上游的那个启动子带的是什么样的组织特异性的启动子然后呢，我们就可以控制这个重组是发生在什么组织里边的好呃这就是针对这个果蝇的这个三条染色体，然后呢，我们把三条染色体上边靠近着丝粒的位置的这个，每条染色体上边呢，都加入了FRT的这个序列。

你们可以看一下，这里是X染色体，有好多个然后呢，第二染色体的左臂、右臂，第三染色体上的左臂、右臂都加上了这个FRT的这个位点而这个位点呢，大家可以看一下，这个后边这一串数字都是代表它是在这个染色体上的位置，这些位置呢，全部都是靠近这个着丝粒的为什么要靠近着丝粒呢？你们可以看一下，就是说，我们看这个第二染色体，这是它的着丝粒是吧？好，如果这个FRT呢，是位于这一块，位于这一块那在这种情况下的话是不是这个，从这一块开始到着丝粒之间的这些基因你就没办法通过这个同源重组的办法让它重合了，是不是？只有位于这个FRT的这个，跟那个染色体的那个游离端的这些基因呢，才能发生重组，才能发生那个纯合，是不是？所以呢，我们要尽可能地把这个FRT呢放在靠近着丝粒的这个位置，所以呢，你们可以看到这呢，我们显示的全部是靠近着丝粒的位置的位点。

好，那个，我们在做唾腺染色体的时候呢，会给大家详细地讲这个怎么来命名这个不同的区域好，同样，这个带转座酶的果蝇也有很多现成的有的位于X染色体，有的位于第二染色体，有的位于第三染色体然后呢，根据你不同的目的，我们就可以选择，然后来进行杂交[空白_录音]好，那么我们我们自己的遗传实验课，我们有没有办法？想办法把这个通过遗传杂交然后呢，我们就可以在眼睛里边呢获得这个一既有纯合突变的克隆，也有这个非重组的克隆呢？也就是说我们能不能做做出来这个复眼里边呢，是红眼镶嵌的这样一个果蝇？怎么做？你们想一想。

用什么样的果蝇？你们想一想，我们先讲，一会告诉你们咱们用的品系是什么，怎么设计的。

好。

前面我们讲了好多，大家可以看到就是我们很多例子呢，都举的例子呢都是举的是眼睛里边的例子，是吧？另外呢就是我们前边看突变体的时候呢，也给大家看了很多在翅膀上边有很多突变的这个表型。

那实际上果蝇的眼睛和翅膀，这两个组织的话就在研究果蝇的时候呢其实相当于是一个模式组织，然后呢在这个里边呢可以研究很多生物学的问题。

因为你们可以看，这个这两个组织的话其实呢就说你给它有一些突变，突变表型上有一些问题，其实呢对它的生活能力呢完全没有任何影响的，是吧？而且呢这个果蝇的这个大复眼上边呢有好多这个小眼面，一个一个小眼面，总共的话加起来的话有750多个小眼面。

而这些小眼面呢就说在整个的发育过程当中，其实呢是相同的事件发生了700多次。

所以呢你把它的其中一些小眼面发生了突变，让它的细胞成为，或者是组织或者是分子，成为了纯合突变的这个细胞，这样的话我们完全可以不影响它的生活力，而且呢就说旁边的那些没有发生变化的那些组织呢正好呢跟它是一个什么？是在相同的生活环境下发育起来的，然后的话给它是一个天然的什么？天然的对照，是吧？所以呢我们在眼睛里边的话做研究的话是很好的模型。

另外一个呢在翅膀里边也是。

然后呢翅膀里边的话我们也可以同样可以进行Mosaic的分析，也可以做很多很有趣的这个研究。

而且呢这个眼睛、翅膀以及足，这些器官的话实际上在幼虫期的时候呢，它们的就说，我们都可以看到它的那个成虫盘了，也就说将来会发育成这些组织的。

那这里呢是有一张对应图，也就说我们果蝇的翅膀在幼虫期的时候呢就有一个翅成虫盘。

我们的果蝇的复眼和触角在幼虫期的时候呢就有一个眼和触角的成虫盘。

同样，这个足呢有相应对应的这个足的成虫盘。

好，我们在解剖这个果蝇的那个唾腺染色体，做唾腺染色体的时候，解剖的时候呢，到时候呢大家呢同样也注意-一下这个成虫盘。

好。

这里呢就是我们把这个幼虫解剖，解剖了以后呢把这个几丁质的这个把它翻出来，就说内侧的那个成虫盘给它翻出来，然后呢看。

大家可以看到，这个旁边的这个，这就是那个足的成虫盘，然后翅的成虫盘呢在这。

然后呢眼睛和触角的那个成虫盘呢在前边。

我们再看一下这个放大。

好，这就是翅成虫盘。

好，然后呢这就是眼成虫盘，将来会发育成眼睛。

然后呢这个呢是触角的，会发育成触角。

这是那个果蝇的大脑。

然后呢这个是黑色的这就是那个幼虫的那个黑色的口沟。

好，你们可能经常在文献里边如果注意的话可以看到，实际上呢在文献里边呢经常会看到这个成虫盘的这些图。

因为在成虫盘上边的话这个不同的区域，然后呢它是由不同的基因控制的，而且这些基因呢在整个这个翅成虫盘上边，或者是眼睛成虫盘上边的话，它是有浓度、梯度的。

所以的话我们根据这个的话可以研究不同的生物学问题的。

[空白_录音]好。

大家可以看一下就说这个整个这个小眼面的话，实际上呢它是有八个感光细胞组成的。

这感光细胞呢随着这个发育时期往后推移的话，它是陆续地形成的。

那在这个眼成虫盘上的话实际上呢就说它是那个什么呀，就说不同的细胞分裂期然后呢都可以看得很清楚的。

所以呢你看可以用不同的这个颜色，GFP或者是RFP给予标记，我们可以看得很清楚的。

好。

我们看一下这个一个小眼面，然后呢它的纵切面和横切面，那大家可以看这个黄色的这个区域呢，就是这个小眼面之间的这个小刚毛，然后呢这个红色的这个细胞呢，实际上呢都是外围的色素细胞，然后呢中间这个八个细胞呢是感光细胞。

[空白_录音]好。

回到我们今天的杂交实验，那么就说我们要做的这个杂交的话就是用的这个FRT和FLP这个系统。

那么我们让其中的一个果蝇作母本，一个果蝇作父本，然后呢你们可以看一下这两个母本和父本之间的这个基因型，差别在哪里？那我们看一下这个是w负，也就说白眼的这个基因，是吧？所以呢这个FLP呢是位于第一染色体上边，而且呢是果蝇是什么颜色的？白眼的，是吧？FRT呢是位于第二染色体的左臂还是右臂？第二染色体的右臂上边的FRT。

好，那么另外一个个体呢，大家可以看，同样在X染色体上呢带的是白眼的基因，然后呢上边有FLP，第二染色体上的右臂上边呢也带着FRT，是吧？两个的唯一的区别是什么？右边这个果蝇还带着一个mini-white的这个基因，是吧？那所以呢这个果蝇呢应该是什么眼睛的？红眼睛的，是吧？好，而这两个果蝇呢在相同的位置呢都带着FRT，是不是？如果杂交以后的话，在FLP的作用下就会发生同源重组，是不是？好，然后的话我们可以看到什么样的表型和基因型呢？[空白_录音]好，我们通过这个图示来给大家看一下。

那我们右边这个果蝇然后呢它在X染色体上边呢是带着白眼基因，所以的话眼睛是白色的，是吧？好，上边呢这个在X染色体，在第二染色体的右臂上边呢带着FRT，上边呢同时呢带着突变。

好，然后呢另外一只果蝇呢也是同样带着FRT，是在相同的位置，也就是在第二染色体的右臂上边。

好。

因为它上边带着一个mini-white的这个基因，这个基因呢是用P因子引入的。

好。

它是红眼的。

实际上是一个转基因果蝇，是吧？是个红眼的。

所以呢这两个果蝇一杂交以后呢形成了杂合体，是吧？在FLP的作用下，然后呢它就会形成这三个细胞，是吧？好，然后呢经过发育的过程，从幼虫期然后呢发育以后呢，到成虫的时候呢我们就可以看到有突变的白眼的果蝇的区域克隆，然后呢有这个杂合体的也有野生型的。

野生型的是因为是有两个拷贝的mini-white的，所以呢颜色更深一些；然后呢杂合的这个呢只有一个拷贝的mini-white，所以呢，颜色呢稍微浅一些。

好两侧的这个果蝇呢，就是我们做杂交，然后呢，做出来的表型然后呢，照出来的照片，你们可以看一下，我们就可以做到这个Mosiac的这个表型的借过来目的是什么？再回到我们最开始的目的是什么？看到这样的果蝇我们目的是干什么？[空白_音频]我们白眼的区域是从何突变的？是吧？然后呢，就可以看它跟野生型的有什么区别如果表面上看不到，我们可以通过染色或者是通过这个切片，然后呢，或者是GFP标记，然后呢，看在细胞水平上发生没发生什么样的变化，然后呢，我们再进一步地通过不同的方法然后呢看，跟野生型的比较，究竟那个白眼的这个突变区域发生了什么样的变化，去观察这个表型区然后呢，再来推测它的正常的功能是什么好我们今天实验操作呢是这样，这个雌的雄的各选5只然后呢，每人做一瓶。

然后呢，今天的培养瓶呢，我们就不拿回去了然后呢，大家呢就，我们放到果蝇的那个培养箱里边，放在实验室里边。

然后呢，下周呢，我们再来上实验课的时候呢我们呢就可以把今天放进去的亲本去掉然后呢，再过一周的话，我们就可以观察这个复眼的表型了好。

我们今天这个做的杂交的话正交和反交有区别吗？你们想想有没有区别？没有区别是吧？好，所以我们今天呢给大家准备的果蝇呢是这样，这个一种基因型的雌的全是，我们已经分开了雌的全是处女蝇然后呢，你们拿到的果蝇的话，要看清楚了，你们如果是拿到的是白眼的看它是雄的还是雌的如果是白眼的雌的，那就以它做母本如果是拿到红眼的雌的，那就是以红眼的雌的做母本然后呢，另外一个呢做父本，听明白了吧？好涉及到这个实验报告的思考题的话，是这样，就是说我们前边呢，给大家出过这个题，然后呢，我们现在呢，实际上你们就可以来回答这些问题了另外呢，在这个基础上呢，我们另外呢还有一些问题，就是说Mosaic的这个杂交实验的话，我们在实验讲义上边是没有的只是给了大家文献，然后呢，我们在课上讲了所以的话，就说这个实验原理是什么？实验的目的是什么？然后呢，大家呢都自己来写一下按照我们实验那个报告的，实验指导上边的那种方式来写另外呢，实验当中呢，我们涉及到的这个杂交图，它的表型啊然后基因型是什么？实际上我刚才PPT里边都已经给大家了第三个的话，可能对你们来说呢，是一个锻炼也是一个挑战那么，这个呢主要是什么？就是说，用我们在课上讲的以及你们学过的一些基本知识然后呢，你们自己去设计实验，就是说你们看你们想研究什么样的问题然后呢，在什么样的组织里边然后呢，我们最开始怎么拿到突变体然后呢，拿到突变以后呢，我们怎么让它重合然后呢，怎么让它如果是致死的，我们用什么样的系统？然后来设计，如果是肉眼看不到表型，然后的话，用GFP啊，或者RFP啊，怎么来标记，然后呢我们讲过的这些知识，你们自己可以针对你们自己感兴趣的，然后呢设计一个实验，就是说，符号的话你们可以那个什么，就是说自己可以设计比方说，我们用平衡染色体，当然是有现成的基因型了，是吧然后呢，GFP的话，也是有现成的基因型的但是呢就是，GAL4的话，前面加什么样的promoter，那你们前边呢那个promoter呢，可以写你们自己感兴趣的某一个组织，用中文写出来都可以然后呢，设计这个所有的这个整个思路以及杂交图，看看你们究竟能做到什么程度，也就是说，我们课上讲的你们理解到什么程度，你们能做到什么程度探索我們的目錄免費加入並獲得個性化推薦、更新和優惠。

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