利用Flp-Frt系统建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠
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其次,利用Flp重组酶,可以特异的删除两个FRT序列间的“STOP“原件, ... [0008] 本发明的原理是:利用双转基因和Flp-Frt技术,在CRE的翻译起始密码子前加入一个“STOP ...
CN102373237A-利用Flp-Frt系统建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠
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利用Flp-Frt系统建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠
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唐安
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高翔
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2010-08-26
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O
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0.000
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Abstract
传统的Cre转基因很难做到很精确的组织特异性表达。
本发明基于双转基因和Flp-Frt技术进行了创新。
首先,在Cre的翻译起始密码子前加入一个“STOP“原件,可以抑制下游Cre的表达。
在“STOP“原件的上下游各加上一个Frt序列。
其次,利用Flp重组酶,可以特异的删除两个FRT序列间的“STOP“原件,这时其下游的Cre重组酶可以表达。
在Cre和Flp的表达质粒前各加上组织特异性的启动子,只有在这两个启动子都表达的组织Cre才会表达。
其有益效果是对传统的组织特异性Cre转基因载体的构建方法上进行了改良与创新。
用两个特异性的启动子的交集来标定Cre的正确组织特异性与时间特异性,促进了利用条件性基因敲除小鼠对基因功能的研究,以进一步应用于医学和药物靶点的研究。
Description
利用Flp-Frt系统建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具
鼠
技术领域
[0001] 本发明涉及一种新的嵌套型组织特异性Cre工具鼠的建立,具体涉及利用Flp-Frt系统和双转基因技术建立嵌套型组织特异性表达的Cre工具鼠的新技术,属于生物技术领域。
背景技术
[0002] 条件性基因敲除技术是研究基因功能,并进一步应用于医药研究的一个重要手段。
组织特异性表达Cre转基因鼠是条件性基因敲除技术重要工具被广泛应用于科学研究和医药研究。
Cre重组酶于1981年由Sternberg发现于Pl噬菌体。
基因有1029个碱基(GeneID:2777477),编码大小约38K的蛋白,属于λInt酶超基因家族(integrasesuperfamily),是一种位点特异性重组酶,它能识别部分回文的IoxP序列(5‘-ATAACTTCGTATA-ATGTATGC-TATACGAAGTTAT-3‘),并通过分子间重组将相同方向的LoxP序列间的核苷酸序列有效切除。
20世纪80年代中期,分子生物学家首先注意到这种酶并把它应用到高等生物中,他把一段两侧带有LoxP位点的基因导入培养细胞的基因组中,同时转入Cre基因使蛋白在细胞内表达,结果证明LoxP位点之间的片段被切除。
1994年Gu.H等首次将Cre-LoxP系统应用到基因打靶中,建立了组织特异性基因打靶小鼠。
常规的全体基因敲除由于会破坏胚胎发育所必须的基因而导致胚胎期致死,从而无法获得成体动物进行下一步研究。
组织特异打靶避免了常规基因敲除的缺陷。
通过同源重组的方式将LoxP序列装入具有重要功能序列两侧的内含子中,就可以产生条件性靶向标记小鼠(floxedmice),因为LoxP不会影响目标基因的转录和翻译。
组织特异性基因敲除小鼠可以通过floxed小鼠与组织特异表达Cre小鼠的杂交产生。
目标基因将会在表达Cre的组织细胞中被破坏,而在其他Cre没有表达的组织细胞中保持原样。
目前世界上已经构建的Cre表达小鼠品系已有数百种。
构建组织特异性Cre表达小鼠大部分采用转基因的手段,由组织特异性启动子引导Cre在特定组织中表达。
因为转基因方法中导入的DNA片段采取随机插入的形式,使得插入位点和插入的拷贝数都无法控制。
转入基因可能插入异染色质区导致基因沉默无法表达;也可能进入活跃表达的区域导致背景表达量过大,特异性不明显。
[0003] Flp/Frt系统是Cre/loxP系统在真核细胞内的同源系统。
与Cre/loxP系统相同,Flp/Frt也是由一个重组酶(Flp)和一段特殊的DNA序列组成(Frt)。
其中.重组酶Flp是酵母细胞内的一个由423个氨基酸组成的单体蛋白。
与Cre相似,Flp发挥作用也不需要任何辅助因子,同时在不同的条件下具有良好的稳定性。
该系统的另一个成分Flp识别位点(Flprecognitiontarget,FRT)与IoxP位点非常相似,同样由两个长度为13bp的反向重复序列和一个长度为8bp的核心序列构成(5'-GAAGTTCCTATTCtctagaaaGTATAGGAACTTC-3'.)。
Flp可以介导两个同方向的Frt序列之间的核苷酸序列通过同源重组发生有效的切除。
目前,Flp/Frt系统也被广泛的应用于以果蝇和小鼠为模式动物的科学研究中。
[0004] “STOP"原件是由三部分组成:550bp的酵母基因His3C端序列,825bp的SV40PolyA加尾信号,以及一段人工合成的寡核苷酸序列(5’-GATCTGACA-ATGGTAAGTAACCT-3,,这里ATG是一个假的翻译起始序列,GTAAGT是一个5’的剪接供点)。
将这个原件加到所需表达的编码序列前面,可以有效的阻止下游编码序列的表达。
在“STOP“原件两边加上同方向的Frt序列,通过表达Flp重组酶,就可以在Flp重组酶表达的细胞中切除“STOP“原件,使得下游的编码序列可以表达。
[0005] 内含子(Intron)属于基因中非翻译序列,存在于外显子(Exon)之间。
很多内含子具有调控基因转录以及未成熟mRNA剪切的作用。
兔β珠蛋白内含子是兔β珠蛋白基因中的一段内含子,将其置于启动子后、翻译起始位点之前可以增强外源基因在真核系统中的表达。
绝缘子(Insulator)是一类DNA元件,可以使启动子不受附近调控元件的干扰。
本发明中所用的绝缘子是鸡β球蛋白基因位点5’末端的一段序列,它可以在真核表达中起到绝缘子的作用,即保证绝缘子之间的转基因序列不受插入位点附近其他DNA原件的影响。
[0006] 虽然组织特异性Cre转基因工具鼠在现金科研中有着广泛的应供。
但是由于Cre转基因的组织特异性主要决定于转基因启动子的选择,而且目前对于组织特异性启动子的研究还不十分完全,因此,目前,真正的组织特异性Cre转基因工具鼠还不是很多。
不少组织特异性Cre工具鼠都存在“表达泄漏“的问题,即在不需要的组织或时间表达。
同时,转基因的随机插入,插入位点周围的DNA序列也会影响组织特异性Cre工具鼠表达。
这些问题影响了对条件性基因的表型,产生表型的机制分析以及对基因功能的研究。
发明内容
[0007] 本发明的目的是找到制作真正的组织特异性Cre工具鼠的方法,可以大大方便利用条件性基因敲除和条件性转基因技术对基因功能进行研究,以进一步应用于医学和药物靶点的研究。
[0008] 本发明的原理是:利用双转基因和Flp-Frt技术,在CRE的翻译起始密码子前加入一个“STOP“原件,可以抑制下游CRE的表达。
在“STOP“原件的上下游各加上一个Frt序列,利用Flp重组酶,可以特异的删除两个Frt序列间的“STOP“原件,这时其下游的ere重组酶可以表达。
我们在Cre和Flp的表达质粒前各加上组织特异性的启动子,只有在这两个启动子都表达的组织Cre才会表达,大大提高Cre表达的组织特异性(见图1)。
我们以FoxP3-Flp/⑶4-Cre双转基因小鼠作为示例说明本发明的实际应用(见图2)。
[0009] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的,首先,真核表达Flp重组酶的工具载体pBS-Pr-Flp的构建,其方法包括如下步骤:
[0010] 步骤一、PCR扩增Flp片段,同时通过PCR带入的酶切位点。
测序验证Flp序列正确。
将Flp片段取代pBS185质粒(Gibico)的中的Cre片段。
[0011] 步骤二、以PCre-ER载体为模板,PCR扩增兔β珠蛋白内含子(简称intron),测序验证正确。
将intron片段通过酶切连接到pBS185_Flp载体的Flp片段前面。
[0012] 步骤三、将intron-flp-pA片段从pBS185载体上切下来连接到pBluescript-KS(+)载体(Stratagene)上。
PolyA加尾信号来自pBS185载体,为金属蛋白酶加A信号。
[0013] 至此工具载体构建完成。
intron前面的多克隆位点中可用于酶切连接加入组织特异性的启动子。
也可通过同源重组在intron-flp-pA片段前加入所需的组织特异性启动子。
这里,我们在intron-flp-pA片段前加入CMV启动子(简称pCMV_Flp),用于两个工具载体在体外细胞系水平上的验证;并且在intron-flp-pA片段前通过同源重组加入FoxP3的启动子(简称FoxP3-Flp),以FOXP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠作为示例说明本发明的实际应用。
[0014] 其次,真核表达Cre重组酶的工具载体pBS-Pr-STOP-Cre的构建,其方法包括如下步骤:
[0015] 步骤一、从pBS185载体上将Cre-pA片段切下,克隆到pBluescript-KS(+)载体上。
[0016] 步骤二、以pBS302载体为模板,PCR扩增“STOP“片段,同时在引物两端引入Frt序列,PCR的结果是”STOP“片段两段加上两个同向的Frt序列。
测序验证正确。
将两端有Frt序列的“STOP“片段(仍称为”STOP“片段)插入pBS-Cre质粒的Cre片段前面。
[0017] 步骤三、将兔β珠蛋白内含子(简称intron)片段插入pBS-STOP-Cre质粒的Cre片段前面。
[0018] 步骤四、在intron片段的上游和polyA加尾信号的下游加入绝缘子(insulator片段,从plnsulator载体得到)。
[0019] 至此工具载体构建完成。
Insulator与intron之间的多克隆位点中可用于酶切连接加入组织特异性的启动子。
也可通过同源重组加入所需的组织特异性启动子。
这里,我们在Insulator与intron之间加入CMV启动子(简称pCMV-STOP-cre),用于两个工具载体在体外细胞系水平上的验证;并且在Insulator与intron之间加入⑶4的启动子(简称CD4-ST0P-Cre),以FoxP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠作为示例说明本发明的实际应用。
[0020] 再次,使用pCMV-STOP-Cre和pCMV_Flp在HEK293细胞系中进行验证。
我们在细胞中共转P1452质粒来检测Cre重组酶的特异性性和表达效率。
pl452质粒中有一个LoxP序列包围的Neo片段。
[0021] 步骤一、在HEK293细胞中以不同组合转染pCMV-STOP-Cre,pCMV-Flp和pl452三种质粒。
[0022] 步骤二、分别提取HEK293细胞的DNA,RNA和细胞总蛋白。
[0023] 步骤三、在蛋白水平和RNA水平检测Cre和Flp重组酶的表达。
[0024] 步骤四、用PCR检测pl452中两个LoxP的切除效率,以检测Cre重组酶的特异性和表达效率。
[0025] 最后,以FoxP3-Flp/⑶4-STOP-Cre双转基因小鼠作为示例说明本发明的实际应用。
[0026] 步骤一、对FoxP3_Flp和CD4-ST0P_Cre两个载体进行线性化,以摩尔比一比一进行原核注射。
根据转基因插入的特点,可以得到FoxP3-Flp和⑶4-STOP-Cre质粒交替插入一个位点的转基因品系,后代不会分离。
[0027] 步骤二、用Flp和Cre特异性PCR引物鉴定基因型,双阳性小鼠称为Founder。
[0028] 步骤三、每只Founder鼠,与B6小鼠交配以保持小鼠品系,鉴定Fl小鼠的Cre的组织特异性表达。
5[0029]本发明基于双转基因和Flp-Frt技术对传统的Cre转基因技术进行了创新。
在Cre的翻译起始密码子前加入一个“STOP“原件,可以抑制下游Cre的表达。
在“STOP“原件的上下游各加上一个FRT序列。
其次,利用FLP重组酶,可以特异的删除两个FRT序列间的“STOP“原件,这时其下游的Cre重组酶可以表达。
具体应用时在Cre和Flp的表达质粒前各加上组织特异性的启动子,只有在这两个启动子都表达的组织Cre才会表达(见图1)。
首先我们建立了两个工具质粒:pBS-Pr-Flp和pBS-Pr-STOP-Cre。
然后我们在Flp重组酶之前以及Insulator与intron之间均加入CMV启动子(简称pCMV-Flp和pCMV-STOP-Cre),对这两个工具载体在体外细胞系水平上的验证(见图3)。
最后我们在Insulator与intron之间加入CD4的启动子(简称CD4-ST0P-Cre),以FoxP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠,建立在CD4+Treg细胞中特异表达的Cre转基因,以此作为示例说明本发明的实际应用(见图2)。
附图说明 [0030] 图 1为嵌套型双转基因组织特异性Cre工具鼠的基本原理图。
[0031] 图 2为FoxP3-Flp和CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠载体设计图。
[0032] 图 3为pCMV-STOP-Cre和pCMV_Flp载体设计图。
[0033] 图 4为Flp重组酶的工具载体pBS-Pr-Flp的构建流程图。
[0034] 图 5为pBS-Pr-Flp质粒图谱。
[0035] 图 6为Cre重组酶的工具载体pBS-Pr-STOP-Cre的构建流程图。
[0036] 图 7为pBS-Pr-STOP-Cre质粒图谱。
[0037] 图 8为利用pCMV-STOP-Cre和pCMV_Flp在HEK293细胞系的PCRί 金证图。
[0038] 图 9为利用pCMV-STOP-Cre和pCMV_Flp在HEK293细胞系的蛋白§ 金证图。
[0039] 图 10FoxP3-Flp转基因载体同源重组的流程图。
[0040] 图 11为⑶4-STOP-Cre转基因载体构建的流程图。
[0041] 图 12为FoxP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠Founder基因型鉴定图(1)。
[0042] 图 13为FoxP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠Founder基因型鉴定图(2)。
[0043] 图 14为FOXP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠Cre重组酶表达检测图。
具体实施方式
[0044] 一、真核表达Flp重组酶的工具载体pBS-Pr-Flp的构建(流程见图4),包括以下步骤:
[0045]步骤一、以 Flp-ER(129S4/SvJaeSor_Gt(ROSA)26Sortml(FLP1)Dym/J,stockNo.003946,Jackson实验室)小鼠基因组DNA为模板,PCR扩增Flp片段。
引物为=FlpF=CGGGATCCGCCGCCATGGGGATGCCACAATTTGATATATTATG;FlpR:CGACGCGTTTATATGCGTCTATTTATGTAGG。
划线部分为通过PCR带入的酶切位点。
PCR产物连接至pMDIS-T,酶切鉴定。
将酶切鉴定结果正确的克隆送交金思特科技(南京)有限公司测序,确认正确。
将Flp片段从pMD18T用限制性内切酶BamHI和MluI酶切连接后,使Flp片段取代pBS185质粒(Gibico)的中的Cre片段,酶切验证正确。
[0046] 步骤二、以pCre-ER(来自朱敏生实验室)载体为模板,PCR扩增兔β珠蛋白内含子(简称intron)。
引物为:
[0047] IntronF:AACTGCAGTCGATCCTGAGAACTTC;
[0048] IntronR:GGAATTCCAATTCTTTGCCAAAATGATGAG。
[0049] 划线部分为上下游引物两端加入用于连接的PstI和EcoRI酶切位点。
PCR产物连接至PMD18-T,酶切鉴定。
将酶切鉴定结果正确的克隆送交金思特科技(南京)有限公司测序,确认正确。
将intron片段通过PstI和EcoRI酶切从pMD18T载体上切下,连接到pBS185-Flp载体的Flp片段前面,酶切验证。
[0050] 步骤三、将intron-flp-pA片段用BamHI和HindII内切酶从pBS185载体上切下来连接到pBluesCript-KS(+)载体上。
此片段包含改良型Kozak序列,PolyA加尾信号,为金属蛋白酶加A信号。
pBS-Pr-Flp工具载体的最终图谱见图5,上面显示了为添加启动子而预留的酶切位点。
[0051] 二、真核表达Cre重组酶的工具载体pBS-Pr-STOP-Cre的构建,流程见图6,包括以下步骤:
[0052] 步骤一、从pBS185载体上将Cre_pA片段切下,克隆到pBluescript-KS(+)载体上,为pBS-Cre。
将pBS185质粒XhoI酶切,电泳回收后使用Klenow片段进行末端补平,再用HindIII酶切,得到Cre-polyA片段。
此片段包含改良型Kozak序列,Cre编码序列,MTployA。
使用HindIII位点以及XhoI补平末端将Cre-polyA片段装入pBluescriptIIKS(+)中的HindIII和EcoRV位点之间,酶切鉴定。
[0053] 步骤二、以pBS302载体为模板,PCR扩增“STOP“片段,同时在引物两端引入Frt序列,PCR的结果是”STOP“片段两段加上两个同向的Frt序列。
引物为:
[0054] STOPF:TCCCCCGGGgaagttcctattctctagaaagtataggaacttc-TAGGTCCCTCGACCTGCAGCC;
[0055] STOPR:GGAAllCgaagttcctatactttctagagaataggaacttc-ATTAAGGGTTCCGGATCCTCG0
[0056] 其中,小写部分为两侧的Frt序列,划线部分为上下游引物两端加入用于连接的SmaI和EcoRI酶切位点。
将两端有Frt序列的“STOP“片段(仍称为”STOP“片段)通过SmaI和EcorI限制性内切酶切,连接,插入pBS_Cre质粒的Cre片段前面。
酶切验证正确。
[0057] 步骤三、将兔β珠蛋白内含子(简称intron)片段从pMD18T载体上用SmaI酶切,连接到pBS-STOP-Cre质粒的Cre片段前面。
酶切验证正确。
[0058] 步骤四、在intron片段的上游和polyA加尾信号的下游加入绝缘子(insulator片段,从plnsulator载体得到)。
以plnsulator为模板PCR扩增Insulator片段,同时加入酶切位点。
引物为:
[0059] InstulatorlF:GAGCTCGCGGCCGCAGCTCGCTAGAGGGACAG
[0060] InsulatorlR:ACTAGTAGGCCTGCATGCGTCGACGCTAGC~TCGCTAGAGCCCCATCCTCAC
[0061] Insulator2F:CTCGAGTAGCTCGCTAGAGGGACAG
[0062] Insulator2R:GGTACCGCGGCCGCTCGCTAGAGCCCCATCCTCAC
[0063] 划线部分为上下游引物两端加入用于连接的酶切位点。
将PCR片段连接到pMD18T载体,测序确认片段序列均正确。
使用酶切,将Insulatorl加入到intron片段的上游,Insulator2加入到polyA加尾信号的下游。
酶切验证正确。
pBS-Pr-STOP-Cre工具载体的最终图谱见图7,上面显示了为添加启动子而预留的酶切位点。
[0064] 三、使用pCMV-STOP-cre和pCMV-Flp在HEK293细胞系中进行验证。
我们在细胞中共转pl452质粒来检测Cre重组酶的特异性性和表达效率。
pl452质粒中有一个IoxP序列包围的Neo片段。
本实施例包括以下步骤:
[0065] 步骤一、在HEK293细胞中以不同组合转染pCMV-STOP-cre,pCMV-Flp和pl452三种质粒。
我们在两个工具载体的预留启动子区,通过酶切连接,插入了广泛表达的CMV启动子(来自于pcDNA3.1)。
第一天,将HEK293细胞以5x10s的细胞密度铺在一个六孔板中。
第二天,当细胞长至90%满,以不同组合按lipofectamindOOO的说明书进行转染。
以1:1:1共转pCMV-STOP-cre,pCMV-Flp和pl452作为实验组;以1:1:1共转pCMV-STOP-cre,pcDNA3.1和pl452,以及共转pcDNA3.l,pCMV_Flp和pl452作为对照组。
为了验证intron对于下游Cre重组酶的表达影响,同时做了不带intron的Cre表达载体的实验作为对照。
转染复合物与细胞于37度孵育4小时,然后将培养液换为普通培养液(DMEM培养基+10%血清),培养细胞24小时。
[0066] 步骤二、分别提取HEK293细胞的DNA,RNA和细胞总蛋白。
转染后的HEK293细胞分别按标准操作提取DNA,RNA和蛋白用作下一步检测。
吸去培养基,用PBS缓冲液小心的洗涤细胞。
DNA的提取方法为:加入细胞DNA裂解液500μ1(加入PK终浓度lmg/ml),于55度消化过夜;第二天,用酚氯仿抽提法提取细胞DNA,最后用TE缓冲液溶解DNA,用于PCR检测。
RNA的提取方法(提取过程中保持无RNA酶):每个6孔板的孔的细胞加入ImlTriblue裂解液(Takara),按标准操作提取RNA,最后溶于DEPC水中;取2μgRNA,用DNA酶I进行处理,以去除DNA污染;取其中1μgRNA用于逆转录(20μ1体系,使用Takara试剂盒),1μgRNA用于对照实验;逆转录得到cDNA用于PCR检验。
蛋白的提取方法为:每个6孔板的孔的细胞加入100μ1蛋白裂解液(RIPA蛋白裂解液,蛋白酶抑制剂以1:100稀释加入,Sigma),将细胞从孔板上刮下,于1.5ml离心管中,在4度摇晃1小时,12000转离心,吸上清为细胞总蛋白,用于western印迹检测。
[0067] 步骤三、在蛋白水平和RNA水平检测Cre和Flp重组酶的表达。
我们用Cre和Flp的特异性引物对cDNA进行PCR,检测转染细胞中Flp和Cre重组酶RNA水平的表达情况。
引物序列为:
[0068] CreF:ATCAACGTTTTCTTTTCGG
[0069] CreR:ATTTGCCTGCATTACCGGTC
[0070] FlpF:CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC
[0071] FlpR:CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG
[0072] 如图8所示,转染的细胞可以成功的表达Cre和Flp;对RNA的PCR作为阴性对照,可以看到RNA中并没有DNA污染。
[0073] 我们用Cre的抗体对蛋白进行western印迹检测,检测转染细胞中Cre重组酶蛋白水平的表达情况。
如图9所示,只有同时转染Cre和Flp的细胞可以表达Cre蛋白。
同时在Cre序列前加入intron,可以大大提高Cre蛋白的表达量。
[0074] 步骤四、用PCR检测pl452中两个IoxP的切除效率,以检测Cre重组酶的特异性和表达效率。
我们使用P1452两个IoxP上下游的特异性引物,检测两个IoxP的切除效率,以此指针Cre酶的表达效率。
如图8所示,只有同时转染Cre和Flp的细胞可以得到检测两个IoxP的切除的PCR产物。
同时在Cre序列前加入intron,可以大大提高Cre的表达效率。
[0075] 四、在CD4+Treg细胞中特异表达的FoxP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠。
[0076] 包括以下步骤:
[0077] 步骤一、FoxP3-Flp转基因载体的构建。
我们使用同源重组的方法,把FoxP3上游IOK的启动子区序列从BAC(RP23-143D8)上重组到Flp上游(参见Zhouetal.,JEM,2008)使FoxP3的翻译起始密码子ATG与Flp片段的ATG密码子重合,这样Flp序列可以在FoxP3启动子驱动下,使用FoxP3的翻译框进行表达。
同源重组的流程见图10,其中A,B为两个用于同源重组的小臂。
最后的质粒我们使用酶切验证,并且对同源重组的接头部分进行了测序验证,确认正确。
[0078] 步骤二、⑶4-STOP-Cre转基因载体的构建。
我们使用酶切连接的方法将⑶4的启动子插入pBS-Pr-STOP-Cre载体STOP片段的上游为启动子预留的位置。
⑶4的启动子分为三个部分:核心启动子部分,增强子部分和沉默子部分(Sawadaetal.,cell,1994)。
我们把三个部分分别以基因组DNA为模板,通过PCR扩增出来,克隆到pMD18T载体上,测序证明序列正确。
引物为:
[0079] CD4enhancerf:ACGCGTCGACATCCCCAACCAAGCCAAGG
[0080] CD4enhancerr:GGAATTCGAAGCTGCAACTAGAAGGACC
[0081] CD4Prf:GGAATTCTAGAACAGCCGACTTAGTG
[0082] CD4Prr:AACTGCAGCAGTGTTCTTGATTGCATG
[0083] CD4silencerf:AACTGCAGCAAGAGAAGCAGGGGTTACAG
[0084] CD4silencerr:AACTGCAGCAAGAGAAGCAGGGGTTACAG
[0085] 把CD4启动子的三个部分片段组合连接到pBlueSCript-KS(+)载体上,酶切验证。
把组合好的CD4的启动子片段从pBlueSCript-KS(+)载体上切下来,通过NotI和由SalI补平的平末端连接到pBS-Pr-STOP-Cre载体STOP片段的上游为启动子预留的位置。
克隆的过程见图11。
最后的质粒我们使用酶切验证,确认正确。
[0086] 步骤三、对FoxP3_Flp和CD4-ST0P_Cre两个载体进行线性化。
FoxP3_Flp使用NotI和KpnI进行线性化。
OM-STOP-Cre使用NotI线性化。
线性化的片段以摩尔比一比一进行原核注射。
根据转基因插入的特点,可以得到FoxP3-Flp和⑶4-STOP-Cre质粒交替插入一个位点的转基因品系,后代不会分离。
[0087] 步骤四、用Flp和Cre特异性PCR引物鉴定基因型,双阳性小鼠称为Founder。
原核注射后得到53个后代,用Flp(见图12)和Cre(见图13)特异性PCR引物鉴定基因型。
引物为:
[0088] CreF:ATCAACGTTTTCTTTTCGG
[0089] CreR:ATTTGCCTGCATTACCGGTC
[0090] FlpF:CACTGATATTGTAAGTAGTTTGC
[0091] FlpR:CTAGTGCGAAGTAGTGATCAGG
[0092] 通过PCR验证,我们得到10只小鼠为Cre和Flp基因双阳性,编号为=1,5,6,17,21,33,36,38,44,530这10只鼠称为Founder小鼠。
[0093] 步骤五、每只Founder鼠,与B6小鼠交配以保持小鼠品系,鉴定Fl小鼠的Cre的组织特异性表达。
我们取出生3天小鼠,使用实验例三,步骤二中所述,抽取RNA,进一步去除DNA污染。
取其中1μgRNA用于逆转录(20μ1体系,使用Takara试剂盒);逆转录得到cDNA用于PCR检验,RNA作为阴性对照。
我们用Cre的特异性引物对cDNA进行PCR,检测转染细胞中Cre的RNA水平表达情况。
如图14所示,在1_6的Fl小鼠中,4,6小鼠可以检测到RNA的表达。
[0094] 除上述实施例外,本发明还可以有其他实施方式。
凡采用等同替换或等效变换形成的技术方案,均落在本发明要求的保护范围。
Claims(4)
1.利用双转基因和Flp-Frt技术,在CRE的翻译起始密码子前加入一个“STOP “原件,可以抑制下游CRE的表达。
在“STOP“原件的上下游各加上一个Frt序列,利用Flp重组酶,可以特异的删除两个Frt序列间的“STOP“原件,这时其下游的Cre重组酶可以表达。
我们在Cre和Flp的表达质粒前各加上组织特异性的启动子,只有在这两个启动子都表达的组织Cre才会表达,大大提高Cre表达的组织特异性。
2.真核表达Flp重组酶的工具载体pBS-Pr-Flp的构建。
这个质粒包括Flp重组酶编码序列,β珠蛋白内含子(简称intron)。
3.真核表达Cre重组酶的工具载体pBS-Pr-STOP-Cre的构建,包括:步骤一、以pBS302载体为模板,PCR扩增“STOP“片段,同时在引物两端引入Frt序列,PCR的结果是”STOP“片段两段加上两个同向的Frt序列。
将两端有Frt序列的“STOP“片段(仍称为”STOP“片段)插入pBS-Cre质粒的Cre片段前面。
步骤二、将兔β珠蛋白内含子(简称intron)片段插入pBS-STOP-Cre质粒的Cre片段前面。
步骤三、在intron片段的上游和polyA加尾信号的下游加入绝缘子(insulator片段,从plnsulator载体得到)。
4. FoxP3-Flp/CD4-ST0P-Cre双转基因小鼠的建立。
包括:步骤一、FoxP3-Flρ转基因载体的构建。
我们使用同源重组的方法,把FoxP3上游IOK的启动子区序列从BAC(RP23-143D8)上重组到Flρ上游(参见Zhouetal.,JEM,2008)使FoxP3的翻译起始密码子ATG与Flp片段的ATG密码子重合,这样Flp序列可以在FoxP3启动子驱动下,使用FoxP3的翻译框进行表达。
步骤二、⑶4-STOP-Cre转基因载体的构建。
我们使用酶切连接的方法将⑶4的启动子插入pBS-Pr-STOP-Cre载体STOP片段的上游为启动子预留的位置。
⑶4的启动子分为三个部分:核心启动子部分,增强子部分和沉默子部分(Sawadaetal.,cell,1994)。
我们把组合好的⑶4通过酶切连接到pBS-Pr-STOP-Cre载体STOP片段的上游为启动子预留的位置。
步骤三、对FoxP3-Flp和⑶4-STOP-Cre两个载体进行线性化。
线性化的片段以摩尔比一比一进行原核注射。
根据转基因插入的特点,可以得到FoxP3-Flp和⑶4-STOP-Cre质粒交替插入一个位点的转基因品系,后代不会分离。
步骤四、用Flp和Cre特异性PCR引物鉴定基因型,双阳性小鼠称为Founder。
步骤五、每只Founder鼠,与B6小鼠交配以保持小鼠品系。
同时与ROSA-GFP小鼠交配以鉴定Cre的组织特异性表达。
带有R0AS-EGFP的小鼠,可以在表达Cre的细胞中特异的表达EGFP。
因此我们可以通过EGFP的表达情况来指针Cre的表达。
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