Plasmid extraction | 原理介紹- ACE Biolabs

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Plasmid extraction | 原理介紹 質體為分子生物學實驗中不可或缺的載體，質體為細胞內環狀DNA片段，在宿主細胞核外仍然能進行DNA複製，包含複製起始點(Origin of ... 首頁 GeneCloning Plasmidextraction|原理介紹2020/03/25 Plasmidextraction|原理介紹   質體為分子生物學實驗中不可或缺的載體，質體為細胞內環狀DNA片段，在宿主細胞核外仍然能進行DNA複製，包含複製起始點(Originofreplication)、細菌抗生素(Antibioticresistancegene)、細胞抗生素(Selectablemarker)、多克隆位點(Multiplecloningsite)、Insert、啟動子(Promoter)及引子結合位點(Primerbindingsite)。

       質體製備包含三個步驟：(1)細菌培養放大(2)菌體收集與裂解(3)質體純化。

而目前最常使用的Plasmidextraction方法為鹼性溶解法(Alkalinelysis)。

以下介紹使用試劑與功用：   (1)Solution1：將菌體懸浮於溶液中 成分 功用 25mMTris-HCl（pH8.0） 緩衝溶液，維持pH值穩定 10mMEDTA 與微生物金屬離子結合，抑制DNase活性 50mMGlucose 增加溶液黏稠度，避免菌體沉降，保持懸浮 RNase 降解溶液內RNA   (2)Solution2：將細胞裂解 成分 功用 250mMNaOH 細胞膜成分為磷脂類物質，利用強鹼使酯鍵斷裂，破壞細胞膜 1％（W/V）SDS 與Solution3反應 *需要注意加入solution2後不可劇烈晃動且時間不能過長，這會使DNA斷裂。

  (3)Solution3：中和solution2強鹼，清除細胞內雜質 成分 功用 3Mpotassiumacetate 與solution2中SDS反應，與變性蛋白質生成不溶於水之potassiumdodecylsulfate(PDS)，進而去除雜質 5Maceticacid 中和強鹼   (4)Washingbuffer： 成分 功用 10mMTris-HCl（pH7.5） 清洗多餘鹽類 80%Ethanol *Washingbuffer中含有高濃度乙醇，乙醇會影響DNA品質，並抑制後續的酶作用反應，在elution前需將乙醇完全去除。

  (5)Elutionbuffer： 成分 功用 10mMTris-HCl（pH7.5） 將管柱內吸附膜上DNA沖堤至乾淨離心管中 *將elutionbuffer預先加熱65-70度可以提高產量。

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