BCT 第二章1

2.1. 質體 DNA 之小量分離法. 回目錄. 這個實驗是以alkaline lysis 的方法進行，其原理是將細菌以NaOH 及SDS 分解，並使蛋白質及DNA 變性，繼之以酸中和。

　 　 　 生物技術方法  卷一 ▼ 生物技術核心實驗  BCT  回首頁          回目錄    　 　 　 第二章 　 　 Contents ．Chapter0 ．Chapter1 ．Chapter2 ．Chapter3 ．Chapter4 ． Appendix 　 　 　 　 　 表現質體的建立 本章目錄 　 Construction ofExpressionPlasmid 　 　 台灣大學農化系     王愛玉   　 　 　 　 　 　 　 　 本章目錄 　 　 　 　 　 2.1   質體DNA的小量分離 圖2.1 　 　 2.2   質體DNA之檢定分析   　 　 2.3   DNA片段的分離與純化 　 　 　 2.4   DNA之定量 　 　 　 2.5   接合反應 　 　 　 2.6   質體對大腸桿菌的轉形 　 　 　 2.7   重組質體的檢定 　 　 　  參考文獻 　 　 　    　詳細目錄    ▲ 　    　 　 本章實驗主要是藉由基本的 DNA剪接方法，建構能夠在大腸桿菌中大量表現GUS 之表現質體(圖2.1)。

將已經次選殖於質體 pBluescriptSK (-)之gusA(原稱uidA)基因片段，以適當的限制脢作用後，選殖至表現載體 pQE31上，以利用其上之T5promoter進行表現。

gusA基因原本即存在於大部分的大腸桿菌中，屬於誘導性的基因 (induciblegene)，當培養基中存在GUS能夠作用的基質(glucuronides)時，即可誘導大腸桿菌中的gusoperon 進行表現GUS,glucuronide-specificpermease,GusC等蛋白質。

由於GUS相當穩定，活性檢測也十分簡易，因此gusA 基因常被應用為報導基因(reportergene)，探討目標基因的表現及其調控機制。

本課程則是利用GUS 相當穩定的優點，作為初學者練習質體建構、基因表現產物分析及純化的材料。

基因表現產物分析及純化等實驗將於第三、四章中說明，表現質體的建構則分別在以下各階段進行： 　 　 2.1 質體DNA的小量分離： 　 　 自 E.coli菌株中分離純化pBlueGus(pBluescript上帶有gusA DNA片段)以及pQE31。

　 　 2.2 質體DNA之檢定分析： 　 　 純化的兩種質體以限制脢進行切割後進行電泳檢定。

　 　 2.3 DNA片段的分離： 　 　 將經過 BamHI與HindIII切割的pBlueGus及pQE31，進行電泳分離，並將 gusADNA片段及pQE31自膠體中溶離出。

　 　 2.4 DNA之定量： 　 　 將溶離出之 gusDNA及pQE31進行定量分析。

　 　 2.5 接合反應(ligation)： 　 　 將 gusADNA片段及經BamHI與HindIII切割之 pQE31以適當比例混合並加入T4DNAligase進行接合反應。

　 　 2.6 質體對大腸桿菌的轉形(transformation)： 　 　 將接合反應液對 E.coliJM109進行轉形，以得到帶有質體之菌株。

　 　 2.7 重組質體的檢定： 　 　 以 colonyhybridization,histochemicaldetection,質體檢定,Southern 轉印等方法，挑選可以表現GUS的轉形株。

　 　 　 　 F2.1 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 　 圖2.1表現質體 pQG11之建構流程(放大圖) 　 　 　 　 　 ■  參考『概說』Slide 3  ▲ 　 　 　 2.1 質體 DNA之小量分離法 回目錄 　 　 　 　 這個實驗是以 alkalinelysis 的方法進行，其原理是將細菌以NaOH及SDS 分解，並使蛋白質及DNA 變性，繼之以酸中和。

在此情況下，小分子質體DNA 在中和後可恢復原態，但大部份的細菌染色體DNA 則無法完全復原而與 SDS-K+ 所形成之複合物一起沉澱下，可以離心去除之，上清液中所含的質体則可以酒精或異丙醇將其沉澱下來。

　 　 　 　 　 儀器用具： 　 　 微量離心機   　 　 冰浴   　 　 真空乾燥濃縮機 (SpeedVac)   　 　 藥品試劑： 　 　 MP I(25mMTris-HCl,pH8.0;10mMEDTA,pH8.0;50mMglucose) 　 　 MP II新鮮配製(0.2NNaOH;1%SDS;使用前以10NNaOH,10%SDS 稀釋混合配製) 　 　 MP III(3M醋酸鉀溶液，pH5.2，置冰浴中) 　 　 RNase A(1mg/mL,已經過100℃加熱30min以去除DNase活性) 　 　 純酒精及 70%酒精 　 　 TE-8.0 (10mMTris-HCl,pH8.0;1mMEDTA,pH8.0) 　 　 方法步驟： 　 　 1) pBlueGus/JM109,pQE31/JM109接種於含100mg/mLampicillin之LB 培養基，於37℃震盪培養過夜。

　 　 2) 取1.5mL菌液，加於微量離心管中，以6,000 rpm離心2min 後，倒去上清，以微量吸管頭儘可能吸去殘留液體。

　 　 ◆ 兩種質體均請製備三管！ 　 　 3) 沉澱加入0.1mLMPI，劇烈震盪，將沉澱完全打散。

　 　 4) 慢慢加入0.2mLMPII，蓋上管蓋後將管子反覆上下搖動，注意不可震盪！ 此時溶液應漸澄清且黏度增加；將離心管置冰浴中。

  　 　 5) 加入0.15mLMPIII，混合均勻，亦不可劇烈震盪，置冰浴中 5min。

　 　 6) 以12,000rpm離心5min。

　 　 7) 小心吸出上清至另一離心管，加入2倍體積之純酒精(或 0.6倍體積之isopropanol)，混合均勻，置室溫2min。

　 　 8) 以12,000rpm離心10min。

倒去上清液，沉澱以70%酒精洗二次，每次各離心 1min。

　 　 ◆ 小心不要把沈澱也倒掉了！ 　 　 9) 沉澱以SpeedVac乾燥後，以30mLTE-8.0溶解(可以微量吸管頭反覆緩慢吸放溶液，以助溶解)。

　 　 ◆ 若無 SpeedVac，可將沈澱置乾燥器(desiccator) 中抽氣乾燥；或將管中殘留之酒精吸乾，在室溫中乾燥或置 laminarflowhood內吹乾。

　 　 10) 加入1mLRNaseA。

　 　 11) 進行限制脢切割、電泳分析等實驗。

　 　 註解討論： 　 　 a. 質體抽取的量與品質除了與操作技術相關外，仍與許多因素有關，例如： 　 　 1.  質體的copynumber。

　 　 2.  宿主菌株的基因型(genotype)。

　 　 3.  細菌的生長時期。

　 　 4.  培養基種類。

有報告指出，利用Terrificbroth或2XYT 等培養基可得較多量之質體。

　 　 b. 上面步驟2)中的菌液體積可加倍至3mL。

將1.5mL 的菌液離心後，倒去上清，再加入1.5mL 菌液，同法離心後，再接著進行質體抽取。

　 　 c. 此法抽取質體，在過程中並無法將小分子RNA 與質體分離，太多的RNA 常會影響電泳結果的判讀或干擾下游的實驗，因此步驟 10)中，加入RNaseA的目的即在去除RNA。

　 　 d. RNase的存在會影響下游的實驗時(例如invitrotranscription)，則可於 RNase作用後，將DNA溶液如下處理： 　 　 1. 加入等體積的phenol/chloroform/isoamylalcohol(PCI,三者以 25:24:1混合)，震盪混合均勻後，以12,000rpm離心5min。

　 　 2. 將上層溶液吸至乾淨離心管，加入等體積chloroform/isoamyl alcohol(24:1,CI)，震盪混合均勻後，以12,000rpm離心2min。

　 　 3. 吸出上層溶液至乾淨離心管，加入2倍體積的酒精及1/10 體積的3Msodiumacetate溶液(pH5.2,以下簡稱3MNaOAc-5.2)，混合均勻，置 -70℃30min或於-20℃靜置3h以上。

　 　 4. 12,000rpm離心15min(4℃)。

沉澱物以70%酒精洗二次，每次各以同轉速離心 2min。

　 　 5. 沉澱乾燥後，以TE-8.0溶解。

　 　 　 　 ▲ TOP ▲ 2.2 質體 DNA之限制脢分析 回目錄 　 　 　 　 本實驗是將上一節分離得到的質體，以不同限制脢作用，經電泳分離 DNA片段後，比較各DNA片段之泳動率與分子量，檢定質體之正確性，並進行大量 DNA之限制脢切割，以進行重組質體的建構。

　 　 　 　 2.2.1 質體 DNA之檢定 　 　 儀器用具： 　 　 37℃及 65℃水浴或恆溫槽 　 　 Mupid II迷你電泳槽及鑄膠器 　 　 UV transilluminator 　 　 防護面罩 　 　 拍立得相機 　 　 藥品試劑： 　 　 2.1 節中以小量分離法得到的二種質體pBlueGus及pQE31 　 　 pBluescript SK(-)由助教提供 　 　 限制脢：BamHI, HindIII(10U/mL,BRL) 　 　 10×Reaction buffer2(0.5MTris-HCl,pH8.0;0.1MMgCl2;0.5MNaCl) 　 　 10×Reaction buffer3(0.5MTris-HCl,pH8.0;0.1MMgCl2;1.0MNaCl) 　 　 1 MNaCl 　 　 無菌水 　 　 10× 追蹤染劑(0.25%bromophenolblue,0.25%xylenecyanol,0.1MEDTA,50% glycerol) 　 　 洋菜膠 (agarose,lowEEO) 　 　 1×TAE 電泳緩衝液 　 　 Ethidium bromide(EtBr)stocksolution(500mg/mL) 　 　 DNA 標準分子量(lMr及LadMr) 　 　 Polarid 667底片 　 　 方法步驟： 　 　 1) 取9支微量離心管，依下表所列(以mL 為單位)依序加於管壁上： 　 　   #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9  pBluescript 2 2 2 - - - - - -  pBlueGus - - - 2 2 2 - - -  pQE31 - - - - - - 3 3 3  10×Rx Buf2 2 2 2 2 2 2 2 2 2  dH2O 16 15 15 16 15 15 15 14 14  HindIII 0 1 1 0 1 1 0 1 1 　 　 ◆ 注意！每次吸取限制脢時，請換新的微量吸管頭以免造成污染。

　 　     總體積為20mL，短暫離心後，以微量吸管頭輕輕混合。

　 　 2) #1,#4,#7暫置冰浴，其餘各管置於37℃反應1h 後，每管再分別依下表所列(以mL 為單位)依序加於管壁上： 　 　   #1 #2 #3 #4 #5 #6 #7 #8 #9  1 MNaCl 1 1 1 1 1 1 1 1 1  10×Rx Buf3 1 1 1 1 1 1 1 1 1  dH2O 8 8 7 8 8 7 8 8 7  BamHI 0 0 1 0 0 1 0 0 1 　 　     總體積為30mL，短暫離心後，以微量吸管頭輕輕混合。

#3,#6,#9置於37℃繼續反應1h，其餘各管置於冰浴中。

　 　 ◆ 在反應期間，每組請利用空檔製備12-well及6-well的1% agarosegels各二片；其中一片12-wellgel必須做厚一點。

　 　 ◆ 注意！Ethidiumbromide 為致突變劑，操作時請務必戴手套，並禁止戴著手套的手到處亂摸！ 　 　 3) 每管分別加入3mL10×追蹤染劑，置 65℃水浴5min後，移至冰浴降溫後即可進行電泳分析。

　 　 ◆ 未使用的電泳膠片請以保鮮膜封好，裝入封口袋中，置 4℃冰箱，留至明天使用。

▲ 　 　 　 2.2.2 大量 DNA之限制脢作用 　 　 　 　 　 若電泳分析結果顯示你所純化的質體 DNA質量均佳(請將結果拿給教師或助教看)，則可進行大量 DNA之BamHI及HindIII切割。

　 　 　 　 　 藥品試劑： 　 　 2.1 節中以小量分離法得到的二種質體 　 　 限制脢：BamHI, HindIII(20U/mL,BioLabs) 　 　 10×NE BufferBamHI(0.1MTris-HCl,pH7.9;0.1MMgCl2;1.5M NaCl;10mMdithiothreitol) 　 　 100×BSA (10mg/mLbovineserumalbumin) 　 　 方法步驟： 　 　 1) 取兩支微量離心管，分別標上pQE31及pBlueGus，如下所列依序加於管中： 　 　  Plasmid  70 mL  10×NE BufferBamHI  20 mL  100×BSA   2mL  dH2O 94 mL  HindIII 7 mL  BamHI 7 mL 　 　 總體積為 200mL，短暫離心後，以微量吸管頭輕輕混合，置37℃反應過夜。

　 　 ◆ 剩餘的質體請保存在4℃，不要丟掉，以後的實驗還會用到！ 　 　 2) pBlueGus取出5mL，pQE31取出10mL，加入追蹤染劑，進行電泳分析，檢視切割是否完全。

　 　 3) 若切割完全，請由2.3節中任選一法進行DNA片段純化。

　 　 註解討論： 　 　 a. 進行大量DNA 的限制脢切割，可選用高濃度的限制脢，以減少反應的體積。

若沒有高濃度的限制脢，則需將反應總體積增加，以避免加入多量的酵素時，過多的 glycerol影響酵素的作用。

　 　 b. 這部份的實驗改用BioLabs 的酵素，所以反應亦依廠商所建議最適條件進行。

　 　 c. 切割完全的pQE31，亦可不進行DNA片段純化，可依2.1 節註解討論d之步驟1~5 進行純化，以去除限制脢及鹽類。

乾燥後之DNA沈澱以 25mLTE-8.0溶解。

但因切下之polylinker 小片段未去除，在進行接合反應時，可能會再與載體接合，降低得到重組質體的機率。

   　 　 　 　▲ TOP ▲ 2.3 DNA 片段的分離與純化 回目錄 2.3.1 DEAE membrane吸附法 　 　 　 　 　 利用離子交換的原理，在低鹽情況下使 DNA 吸附在帶正電荷的濾膜上，再利用含有高濃度鹽類的緩衝液將 DNA自膜上溶離下來。

　 　 　 　 　 儀器用具： 　 　 Mupid II迷你電泳槽 　 　 UV transilluminator 　 　 防護面罩 　 　 扁平藥匙 　 　 乾淨刀片 　 　 65℃ 水浴或恆溫槽 　 　 藥品試劑： 　 　 經 BamHI 及HindIII 作用之 pBlueGus及 pQE31 　 　 含 EtBr之 1.0%12-wellagarosegel 　 　 1×NET (20mMTris-HCl;150mMNaCl;0.1mMEDTA,pH8.0) 　 　 High saltNET(20mMTris-HCl;1.0MNaCl;0.1mMEDTA,pH8.0) 　 　 0.5 MNaOH 　 　 10 mMEDTA 　 　 TE-8.0 　 　 n-Butanol 　 　 Phenol/chloroform/isoamyl alcohol(PCI,25:24:1) 　 　 Chloroform/isoamyl alcohol(CI,24:1) 　 　 10 Mammoniumacetate(NH4OAc) 　 　 DEAE membrane(Schleicher&Schuell,NA45) 　 　 過濾膜 (MilliporeVSWP01300,0.025mm, 13mm) 　 　 方法步驟： ▲ 　 1) 經 BamHI 及HindIII 作用之 pBlueGus及pQE31，置 65℃水浴10min，移至冰浴降溫後，以含 EtBr之1.0%agarosegel進行電泳。

　 　 2) NA 45以滅過菌的剪刀剪成適當大小，置於培養皿中，以 10mMEDTA-8.0浸泡處理10 min，繼以 0.5MNaOH處理 5min。

以無菌水快速清洗五、六次後，浸泡於無菌水中，置於 4℃可保存數週。

　 　 ◆ 此部份助教已準備好。

　 　 3) 電泳後之膠片以 EtBr染色後，以長波長 UV燈觀察DNA片段所在位置，並在 DNA色帶前後切一刀，以扁平藥匙輔助將NA 45插入 DNA前後的切縫中；再以UV 燈觀察 NA45插入的位置是否恰當。

　 　 4) 將膠片置回電泳槽中，以 100V進行電泳約 10min(時間隨NA45位置與 DNA距離而定)；以 UV燈觀察DNA是否完全吸附到 NA45。

　 　 5) 將 NA45取出，浸於 NET中漂洗以去除附著於 NA45的膠體 (可用微量吸管頭末端將膠體輕輕去除)，再移置於微量離心管中 (每2-3片置於一管中)，吸去多餘的液體。

　 　 ◆ 注意！不可讓NA45 乾掉，否則DNA無法被溶離下來。

　 　 6) 加入0.3 mLhighsaltNET，於68℃ 加熱 40min，其間不時震盪。

　 　 ◆ NA45膜片避免重疊在一起，並且必須完全浸泡於溶液中。

　 　 7) 將溶液吸出，原管中之 NA45再加入 300mL highsaltNET，於68℃ 加熱 10min。

　 　 ◆ 以下的步驟常容易出錯，請務必分清楚離心後該取上層或下層溶液，請先保留各部份的溶液，確定無誤後再丟棄。

　 　 8) 將兩次溶離液合併，加入等體積之 n-butanol，震盪混合，以12,000 rpm離心 5min。

離心後應可分為兩層，DNA 溶液在下層。

仔細觀察管底是否有沈澱，吸取下層溶液至另一離心管，避免吸到沈澱。

這時 DNA溶液體積應該減少，可以把兩管或三管的溶液合併成一管。

　 　 ◆ 溶離後的NA45請以UV照射檢查是否仍有DNA殘留。

　 　 9) 加入等體積之PCI，震盪混合，以 12,000rpm離心 5min。

　 　 10) 吸取上層水溶液至另一離心管，原管中加入等體積的 TE-8.0，混合均勻，以 12,000rpm離心 2min。

將上層液吸出。

　 　 11) 合併上層液，加入等體積 CI，震盪混合，以12,000 rpm離心 2min。

　 　 12) 將上層溶液吸出，加入 0.2倍體積之 10MNH4OAc，2.5 倍體積的絕對酒精，置-20℃ 沉澱過夜  (本次實驗請置於-70℃ 30min)。

　 　 13) 以 12,000rpm離心20min(4℃)，沉澱以-20℃ 預冷之 70%酒精洗兩次，以同轉速離心2 min。

　 　 ◆ 倒掉上清時請小心，不要讓沈澱流失！ 沈澱通常很少，且因純度高幾近透明，不易察看；上清最好吸到另一微量試管中暫時保留。

　 　 14) 沉澱乾燥後溶於 20mL TE-8.0中。

　 　 15) 取一個直徑 3 cm之培養皿，加入 5 mLTE-8.0。

以平端鑷子小心夾取 VSWP 濾膜，將濾膜之光亮面朝上置於液面上。

將溶離之 DNA 溶液加在膜上，靜置透析至少 30 min以去除殘留之鹽。

　 　 註解討論： 　 　 a. 當 DNA分子量較大時(> 5kb)，溶離效率會降低。

　 　 b. 步驟6) 中的溶離時間隨 DNA大小而作調整。

DNA 分子量較小時，溶離時間可縮短。

　 　 c. 步驟11) 中儘可能避免在 -70℃進行沈澱，溶液中的鹽會隨之沈澱，因此必須以 dropdialysis(步驟 15)將大量的鹽去除。

　 　 d. 以n-butanol萃取 DNA溶液，主要在去除嵌入 DNA中的 EtBr，並可濃縮溶液的體積。

當溶液體積已經很少時，則需用事先經過水飽和之 n-butanol。

　 　 e. 加入 PCI 及 CI 的用意為何？ PCI溶液為什麼是黃色的？ ▲ 　 　 　 2.3.2 Silica gel吸附法 　 　 　 　 　 藥品試劑： 　 　 經 BamHI及HindIII 作用之 pBlueGus及 pQE31 　 　 含 EtBr之 1.0%12-wellagarosegel 　 　 Concert RapidGelExtractionSystem (Gibco BRL)，內含： 　 　 Spin column(裝填有silica gel) 　 　 Gel SolubilizationBuffer(L1) 　 　 Washing Buffer(L2,含 NaCl, EDTA,Tris-HCl,ethanol) 　 　 TE-8.0 　 　 方法步驟： 　 　 1) 經 BamHI 及HindIII 作用之 pBlueGus及 pQE31，置於 65℃水浴10min，移至冰浴降溫後，以含 EtBr之1.0%agarosegel進行電泳 (兩種樣品各用六個 wells，每個 well注入 30mL 樣品)。

　 　 2) 電泳後以長波長 UV燈觀察DNA片段所在位置，並以乾淨刀片將 GUS及 pQE31片段切下，請儘可能去除周圍多餘的膠體。

　 　 3) 取數個微量離心管，分別稱重後將膠體置於管中再稱重以估計膠體重量。

注意！每管膠體不可超過400 mg。

接著於離心管中加入 GelSolubilizationBuffer(L1)以溶解膠體，加入比例為： 約 10mg膠體加入30mL L1。

　 　 4) 置 50℃ 水浴中作用 15min，每隔3min以手指輕彈管壁促進膠體溶解。

如果膠體尚未溶解完全，則延長作用時間 5-10min務使膠體完全溶解。

　 　 5) 將 spincolumn置於 2mL離心管中，加入已完全溶解之膠體溶液，於 12,000rpm轉速下離心 1min。

此時DNA片段已與 column上之membrane結合，離心完成後，去除離心管之流出物。

　 　 6) 將 spincolumn置回離心管中，加入 500mL GelSolubilizationBuffer(L1)，靜置室溫下 1min，再於12,000rpm轉速下離心 1min，並去除離心管之流出物。

。

　 　 7) 將 spincolumn置回離心管中，加入 700mL WashingBuffer(L2)，靜置室溫5 min後，於 12,000rpm轉速下離心1min，並去除離心管之流出物。

　 　 8) 將 spincolumn置回離心管中，再於 12,000rpm轉速下離心1min，以完全去除離心管中殘留的 WashingBuffer(注意：一定要將washing buffer完全去除，以免干擾後續酵素反應)。

　 　 9) 將spin column置於另一乾淨的離心管中，加入 30mL 已經65℃ 預熱過的 TE-8.0Buffer於silica membrane上，靜置 5min，以將附於膜上之 DNA完全溶離出。

　 　 10) 於 12,000 rpm 轉速下離心 2 min。

收集含有 DNA 的溶離液，並進行 DNA 的定量及接合反應。

　 　 註解討論： 　 　 a. 以 Silicagel法來進行DNA片段的純化，目前有許多商品化的套組 (kit)可利用，可依需求選擇適當的套組。

　 　 b. 一般而言，Silica gel吸附法對較小的 DNA片段(<0.5Kb)回收率並不佳，在使用前須詳閱套組操作說明所列適用片段大小。

　 　 　 　 ▲ TOP ▲ 2.4 DNA 之定量 回目錄 　 　 　 　 藥品試劑： 　 　 純化之 gusA片段及 pQE31BamHI/HindIII 片段 　 　 1% 6-wellagarosegel 　 　 DNA 標準分子量 (lMr, 0.5mg/mL) 　 　 方法步驟： 　 　 1) 取 4 支微量離心管，依下表加入 DNA, TE-8.0及追蹤染劑 (mL)： 　 　   #1 #2 #3 #4  DNA lMr lMr pQE31 gusA 1 2  2  2   TE-8.0 8 7 7 7  染劑 1 1 1 1 　 　 　 　 　 　 　 2) 短暫離心混合後，將各管樣品置 65℃水浴 5-10min後，移至冰浴降溫後進行電泳分析。

　 　 3) 將膠體置於 UVtransilluminator上觀察各色帶的亮度，與已知量之lMr 比較，找出分別與#3, #4亮度相當之片段。

　 　 ◆ 由圖1.5可知lMr每一DNA片段的量。

　 　 4) 估計 #3,#4之 DNA 量及計算每 mL 所含之莫耳數。

　 　 　 　 　 ▼ 接續 2.5節▼    回目錄 ▲ TOP ▲ ■ 最近修訂日期︰ 2004/03/23