腺相关病毒包装| 云舟生物 - 载体家
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云舟生物提供腺相关病毒载体包装,(AAV)腺相关病毒是一种对人类没有致病性的细小病毒。
虽然AAV病毒感染在人类中很常见,但与任何已知疾病无关。
这些特性使AAV成为 ...
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Dual-gRNA慢病毒文库
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COVID-19冠状病毒解决方案
冠状病毒S蛋白假病毒包装
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用于新冠病毒研究的动物模型
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这些产品是在我们先进的设施中严格控制下生成的。
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腺相关病毒包装
腺相关病毒(Adeno-associatedvirus,简称AAV)是一种对人类没有致病性的细小病毒(Parvovirus)。
虽然AAV感染在人类中很常见,但与任何已知疾病无关;加上其转导分裂细胞和静止细胞的能力、非常低的免疫原性以及转基因长期表达(与野生型AAV病毒感染后整合到宿主细胞DNA不同,重组AAV载体主要作为染色体外游离体长期存在),这些特性使AAV成为炙手可热的用于基因治疗的病毒载体。
我们开发出一系列专有技术和试剂,从病毒滴度、纯度、活性以及一致性等方面显著提升了腺相关病毒包装工艺水平。
订购信息
ssAAV
scAAV
Baculovirus-BasedApproach
生产规格
UnitSize
最小滴度
分装
价格(CNY)
周期
ssAAV病毒⼩量制备
>5x1010GC
>2x1011GC/ml
10x25ul
¥3,100.00
10-18天
ssAAV病毒中量制备
>2x1011GC
>2x1011GC/ml
10x100ul
¥4,600.00
10-18天
ssAAV病毒大量制备
>2x1012GC
>2x1012GC/ml
10x100ul
¥7,700.00
10-18天
超纯化ssAAV病毒⼩量制备
>1x1012GC
>1x1013GC/ml
4x25ul
¥9,300.00
16-26天
超纯化ssAAV病毒中量制备
>5x1012GC
>1x1013GC/ml
10x50ul
¥11,300.00
16-26天
超纯化ssAAV病毒⼤量制备
>1x1013GC
>1x1013GC/ml
10x100ul
¥16,900.00
16-26天
生产规格
UnitSize
最小滴度
分装
价格(CNY)
周期
scAAV病毒⼩量制备
>5x1010GC
>2x1011GC/ml
10x25ul
¥3,100.00
10-18天
scAAV病毒中量制备
>2x1011GC
>2x1011GC/ml
10x100ul
¥4,600.00
10-18天
scAAV病毒大量制备
>2x1012GC
>2x1012GC/ml
10x100ul
¥7,700.00
10-18天
超纯化scAAV病毒⼩量制备
>1x1012GC
>1x1013GC/ml
4x25ul
¥9,300.00
16-26天
超纯化scAAV病毒中量制备
>5x1012GC
>1x1013GC/ml
10x50ul
¥11,300.00
16-26天
超纯化scAAV病毒⼤量制备
>1x1013GC
>1x1013GC/ml
10x100ul
¥16,900.00
16-26天
生产规格
UnitSize
最小滴度
分装
价格(CNY)
周期
超纯化AAV病毒⼩量制备
>5x1013GC
>5x1013GC/ml
10x100ul
¥39,200.00
42-56天
超纯化AAV病毒中量制备
>2.5x1014GC
>5x1013GC/ml
25x200ul
¥141,400.00
49-63天
超纯化AAV病毒⼤量制备
>5x1014GC
>5x1013GC/ml
50x200ul
¥267,200.00
57-70天
注意:Baculovirus-basedapproach生产的AAV只可应用于以下的AAV血清型:1、2、5、6、8、9。
病毒类型
我们提供的AAV类型
单链AAV(Single-strandedAAV,ssAAV)和自互补AAV(Self-complementaryAAV,scAAV)
18种血清型:1、2、3、4、5、6、6.2、7、8、9、rh10、DJ、DJ/8、PHP.eB、PHP.S、AAV2-retro、AAV2-QuadYF和AAV2.7m8
AAV空壳和类病毒颗粒(Virus-likeparticle,VLP)
点击查看AAV载体指南 点击查看客户文献点击查看用户评价
我们提供的AAV的包装服务涵盖以下血清型:
按照血清型分类
按照组织嗜性分类
血清型
组织嗜性
AAV1
平滑肌, 中枢神经系统, 肺, 视网膜, 内耳组织, 胰腺, 心脏, 肝
AAV2
平滑肌, 中枢神经系统, 肝, 肾, 视网膜, 内耳组织
AAV3
平滑肌, 肝, 肺
AAV4
中枢神经系统, 视网膜, 肺, 肾
AAV5
平滑肌, 中枢神经系统, 肺, 视网膜
AAV6
平滑肌, 心脏, 肺,脂肪组织, 肝
AAV6.2
肺, 肝, 内耳组织
AAV7
平滑肌, 视网膜, 中枢神经系统, 肝
AAV8
平滑肌,中枢神经系统, 视网膜, 内耳组织, 肝, 胰腺, 心脏, 肾, 脂肪组织
AAV9
平滑肌, 肺, 肝, 心脏, 胰腺, 中枢神经系统, 视网膜, 内耳组织, 睾丸, 肾
AAVrh10
平滑肌, 肺, 肝, 心脏,胰腺, 中枢神经系统, 视网膜,肾
AAV-DJ
肝, 心脏, 肾, 脾
AAV-DJ/8
肝, 脑, 脾
AAV-PHP.eB
中枢神经系统
AAV-PHP.S
外周神经系统
AAV2-retro
脊神经
AAV2-QuadYF
内皮细胞
AAV2.7m8
视网膜, 内耳组织
组织
推荐使用的AAV血清型
平滑肌
AAV1, AAV2,AAV3, AAV5,AAV6, AAV7, AAV8, AAV9,AAVrh10
中枢神经系统
AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7,AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-PHP.eB
外周神经系统
AAV-PHP.S
脑
AAV1, AAV2, AAV5, AAV7, AAV8, AAV-DJ/8
视网膜
AAV1, AAV2, AAV4, AAV5, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV2.7m8
内耳组织
AAV1, AAV2, AAV6.2, AAV8, AAV9, AAV2.7m8
肺
AAV1, AAV3, AAV4, AAV5, AAV6, AAV6.2, AAV9, AAVrh10
肝
AAV1, AAV2, AAV3, AAV6, AAV6.2, AAV7, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
胰腺
AAV1, AAV2, AAV6, AAV8, AAV9,AAVrh10
心脏
AAV1, AAV4, AAV5, AAV6, AAV8, AAV9, AAVrh10, AAV-DJ
肾
AAV2, AAV4, AAV8, AAV9,AAVrh10, AAV-DJ, AAV-DJ/8
脂肪组织
AAV6, AAV8, AAV9
睾丸
AAV2, AAV9
脾
AAV-DJ, AAV-DJ/8
脊神经
AAV2-retro
内皮细胞
AAV2-QuadYF
注意:携带目的基因的转移质粒上的ITR序列来自于AAV2。
一般来说,包装不同血清型的AAV,指的是使用不同血清型的衣壳蛋白表达质粒,与携带AAV2ITR的转移质粒进行包装。
查看不同腺相关病毒血清型病毒衣壳蛋白1(VP1)的氨基酸序列>>
交付内容
ssAAV
scAAV
Baculovirus-BasedApproach
非纯化ssAAV制备服务
纯化ssAAV制备服务
交付内容
定制病毒,按照规格交付:
⼩量制备:>2x1011GC/ml,10x25ul
中量制备:>2x1011GC/ml,10x100ul
⼤量制备:>2x1012GC/ml,10x100ul
定制病毒,按照规格交付:
⼩量制备:>1013GC/ml,4x25ul
中量制备:>1013GC/ml,10x50ul
⼤量制备:>1013GC/ml,10x100ul
对照病毒,按照定制病毒的规格对应赠送:
⼩量制备:>2x1011GC/ml,100ul
中量制备:>2x1011GC/ml,2x100ul
⼤量制备:>2x1011GC/ml,2x100ul
对照病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>1013GC/ml,4x25ul
中量制备:>1013GC/ml,10x50ul
⼤量制备:>1013GC/ml,10x100ul
辅助病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>2x1011GC/ml,10x25ul
中量制备:>2x1011GC/ml,10x100ul
⼤量制备:>2x1012GC/ml,10x100ul
辅助病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>1013GC/ml,4x25ul
中量制备:>1013GC/ml,10x50ul
⼤量制备:>1013GC/ml,10x100ul
病毒重悬液
50mMTris缓冲液(添加150mMNaCl和5mMMgCl2)
pH7.4PBS缓冲液(添加200mMNaCl和0.001%pluronicF-68)
运输/存储
干冰/-80°C,避免反复冻融
干冰/-80°C,避免反复冻融
推荐应用
体外培养细胞转导
体外培养细胞转导、动物体内细胞转导
对照病毒
为了更好地开展您的实验,我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。
例如,如果定制病毒表达一个基因,则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。
如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA,则对照病毒表达一个ScrambleshRNA。
推荐的对照病毒信息如下表所示:
对照病毒
对照载体名称
对照载体ID
定制病毒
EGFP对照AAV病毒
pAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE
VB010000-9394npt
哺乳动物基因表达AAV病毒(包含Tet-On诱导表达和FLEX条件性表达)、哺乳动物AAVCRISPR系统、哺乳动物非编码RNA表达AAV病毒
mCherry对照AAV病毒
pAAV[Exp]-CMV>mCherry
VB900129-0800rvh
ScrambleshRNA对照AAV病毒,EGFP荧光
pAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA
VB010000-0023jze
哺乳动物shRNA干扰AAV病毒
ScrambleshRNA对照AAV病毒,mCherry荧光
pAAV[shRNA]-CMV>mCherry-U6>Scramble_shRNA
VB010000-0024wah
ScramblemiR30-shRNA对照AAV病毒,EGFP荧光
pAAV[miR30]-CMV>EGFP:Scramble_miR30-shRNA:WPRE
VB010000-9397wgw
哺乳动物miR30-shRNA干扰AAV病毒
Tet-OnEGFP对照AAV病毒(选购)
pAAV[Tet_on]-TRE>EGFP-CBh>tTS:T2A:rtTA
VB010000-0053bwh
哺乳动物基因Tet-On诱导表达AAV病毒
FLEX-EGFP对照AAV病毒(选购)
pAAV[FLEX_on]-CMV>rev(EGFP)
VB180820-1044gcq
哺乳动物基因FLEX条件性表达AAV病毒
辅助病毒
为了更好地开展您的实验,我们按照“辅助病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您推荐辅助病毒。
例如,如果定制病毒是一个只含TRE启动子的TetOn慢病毒,则需要一个表达rtTA的辅助病毒,才能进行诱导表达实验。
推荐的辅助病毒信息如下表所示:
辅助病毒
辅助载体名称
辅助载体ID
定制病毒
SaCas9AAV病毒(选购)
pAAV[Exp]-CMV>saCas9
VB180125-1089ffa
哺乳动物gRNAAAV病毒(不含Cas9)
CreAAV病毒(选购)
pAAV[Exp]-CMV>Cre
VB171024-1202yau
哺乳动物基因FLEX条件性表达AAV病毒
非纯化scAAV制备服务
纯化scAAV制备服务
交付内容
定制病毒,按照规格交付:
⼩量制备:>2x1011GC/ml,10x25ul
中量制备:>2x1011GC/ml,10x100ul
⼤量制备:>2x1012GC/ml,10x100ul
定制病毒,按照规格交付:
⼩量制备:>1013GC/ml,4x25ul
中量制备:>1013GC/ml,10x50ul
⼤量制备:>1013GC/ml,10x100ul
对照病毒,按照定制病毒的规格对应赠送:
⼩量制备:>2x1011GC/ml,100ul
中量制备:>2x1011GC/ml,2x100ul
⼤量制备:>2x1011GC/ml,2x100ul
对照病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>1013GC/ml,4x25ul
中量制备:>1013GC/ml,10x50ul
⼤量制备:>1013GC/ml,10x100ul
辅助病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>2x1011GC/ml,10x25ul
中量制备:>2x1011GC/ml,10x100ul
⼤量制备:>2x1012GC/ml,10x100ul
辅助病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>1013GC/ml,4x25ul
中量制备:>1013GC/ml,10x50ul
⼤量制备:>1013GC/ml,10x100ul
病毒重悬液
50mMTris缓冲液(添加150mMNaCl和5mMMgCl2)
pH7.4PBS缓冲液(添加200mMNaCl和0.001%pluronicF-68)
运输/存储
干冰/-80°C,避免反复冻融
干冰/-80°C,避免反复冻融
推荐应用
体外培养细胞转导
体外培养细胞转导、动物体内细胞转导
对照病毒
为了更好地开展您的实验,我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。
例如,如果定制病毒表达一个基因,则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。
如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA,则对照病毒表达一个ScrambleshRNA。
推荐的对照病毒信息如下表所示:
对照病毒
对照载体名称
对照载体ID
定制病毒
EGFP对照scAAV病毒
pscAAV[Exp]-CMV>EGFP:WPRE
VB010000-9304aud
哺乳动物基因表达scAAV病毒
ScrambleshRNA对照scAAV病毒,EGFP荧光
pscAAV[shRNA]-EGFP-U6>Scramble_shRNA
VB010000-9343nhh
哺乳动物shRNA干扰scAAV病毒
纯化AAV制备服务(通过杆状病毒转导Sf9昆虫细胞制备)
交付内容
定制病毒,按照规格交付:
⼩量制备:>5x1013GC/ml,10x100ul
中量制备:>5x1013GC/ml,25x100ul
⼤量制备:>5x1013GC/ml,50x100ul
对照病毒,按照定制病毒的规格对应选购:
⼩量制备:>5x1013GC/ml,10x100ul
中量制备:>5x1013GC/ml,25x100ul
⼤量制备:>5x1013GC/ml,50x100ul
病毒重悬液
pH7.4PBS缓冲液(添加200mMNaCl和0.001%pluronicF-68)
运输/存储
干冰/-80°C,避免反复冻融
推荐应用
体外培养细胞转导、动物体内细胞转导
对照病毒
为了更好地开展您的实验,我们按照“对照病毒与定制病毒的生物学应用相匹配”的原则给您赠送或者推荐对照病毒。
例如,如果定制病毒表达一个基因,则推荐的对照病毒表达荧光蛋白EGFP。
如果定制病毒表达打靶某个基因的shRNA,则对照病毒表达一个ScrambleshRNA。
推荐的对照病毒信息如下表所示:
对照病毒
对照载体名称
对照载体ID
定制病毒
超纯化EGFP对照AAV病毒,杆状病毒感染Sf9方法
pBV-ITR-CMV>EGFP-ITR
VB010000-9306ded
哺乳动物基因表达AAV病毒(通过杆状病毒转导Sf9昆虫细胞制备)
运输/储存
我们的AAV病毒存储在特殊的Tris缓冲液或PBS缓冲液中,并采用干冰运输。
收到AAV病毒后,立即放置于-80℃,可保存约一年。
若放置于-20℃,则可保存2-3周。
融解后的AAV病毒可在4℃保存1-2周。
虽然AAV病毒比其他多数病毒稳定(如慢病毒),但是也请避免反复冻融,因为这会导致AAV病毒滴度显著下降。
生产/质控
三质粒转染法生产AAV
使用杆状病毒生产AAV
步骤
描述
时间
Triple-transfection
我们常规使用的helper-free腺相关病毒包装系统包括1个转移质粒(Transferplasmid)、1个Rep和Cap表达质粒(Rep-Capplasmid)和1个辅助质粒(Helperplasmid),其包装过程是将携带目的基因(GeneofInterest, 简称GOI)和ITR序列的转移质粒、表达特定血清型衣壳蛋白的Rep-Cap质粒和编码介导腺相关病毒复制的腺病毒基因(E2、E2A和VA)的辅助质粒共转染HEK293T包装细胞,这个转染过程称为三质粒转染(Triple-transfection)。
第1天
Supernatantcollection
在细胞里,转导质粒表达包含目的基因(Gene of Interest, GOI)的AAV基因组,Rep-Cap质粒表达特定血清型的AAV衣壳蛋白,辅助质粒表达辅助AAV基因组表达翻译的组分。
三者共同作用从而在细胞中生成完整的AAV病毒颗粒。
细胞短暂孵育后,根据血清型的不同,收集上清或者细胞裂解液获取病毒颗粒
第3天
Concentrationandpurification
PEG浓缩病毒颗粒。
对于超纯化腺相关病毒(体内应用级别),再通过氯化铯(CsCl)密度梯度离心对病毒颗粒进一步纯化和浓缩。
第5天
QualityControl
对病毒采用ITR qPCR方法进行滴度测定(Titerdetermination)、并且还进行微生物检测(Bioburdentest,针对细菌、真菌)、支原体检测(Mycoplasmatest)等。
若转移载体同时编码一个荧光蛋白,我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况(Transductiontest)。
此外,对于超纯化AAV病毒,我们还可以检测内毒素水平(Endotoxintest)和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度(Viruspuritytest)。
第7天及以后
我们的使用杆状病毒包装AAV的工作流程包括两个主要步骤,如图1所示。
步骤1中产生两种重组杆状病毒,第一个表达目的基因(GOI),其两侧有AAV反向末端重复序列(Invertedterminalrepeat,ITR),第二个则是辅助杆状病毒表达AAVrep和cap基因。
在步骤2中,通过将步骤1产生的两种重组杆状病毒共同感染昆虫细胞来产生重组AAV颗粒。
为产生两种重组杆状病毒(一种表达GOI,其两侧是AAVITR;另一种表达AAVrep/cap基因),首先需要将每种杆状病毒的表达盒克隆至杆状病毒转移载体中。
然后将杆状病毒转移载体与表达Tn7转座酶的辅助质粒共转化至含有杆状病毒穿梭空载体(又名杆粒)的细菌宿主中,以产生重组杆粒。
然后将重组杆粒转染到昆虫Sf9细胞中。
经过短暂的孵育期,从培养基中收集病毒颗粒并使用蔗糖梯度密度离心进一步浓缩。
我们采用qPCR测定杆状病毒滴度。
然后将两种重组杆状病毒共感染昆虫细胞中。
在72-96小时的孵育期后,从细胞裂解液和上清液中收集AAV颗粒,并通过PEG沉淀法进行浓缩。
对于超纯化AAV(体内应用级别),AAV病毒颗粒通过氯化铯(CsCl)梯度超速离心进一步纯化和浓缩。
我们使用qPCR测定AAV滴度。
图1Baculovirus-AAV的典型生产流程
对于每个我们生产的AAV,我们的QC包括qPCR滴度测定(Titermeasurement)、微生物检测(Bioburdentest,针对细菌、真菌)、支原体检测(Mycoplasmatest)等。
若转移载体同时编码一个荧光蛋白,我们还会将病毒进行细胞转导以测定相应的荧光表达情况(Transductiontest)。
此外,对于超纯化AAV病毒,我们还可以检测内毒素水平(Endotoxintest)和使用SDS-PAGE方法检测病毒纯度(Viruspuritytest)。
试验验证
我们开发了一系列专有技术用于优化我们的Baculovirus-AAV包装流程。
因此我们的病毒在转导哺乳动物细胞时表现出良好的转导效率。
图2表达EGFP的Baculovirus-AAV转导HEK293T细胞,血清型为AAV1和2,MOI10000。
左:明场。
右:EGFP。
滴度保证
我们的滴度保证仅适用于包装进病毒的区域(从5’ITR到3’ITR)小于腺相关病毒承载限度(4.7kb,~野生型AAV2基因组长度)的载体。
超过该范围,超出4.7kb的那部分序列在包入衣壳时会被剪切掉,导致包装出来的AAV病毒颗粒含有不完整的基因组,不仅影响ITRqPCR滴度检测,而且影响转基因表达。
此外,对于如下情况,我们同样不能保证滴度:
AAV血清型3、4、6、6.2、2.7m8的滴度通常偏低。
对于这些血清型我们保证其滴度是其它血清型最小滴度的50%。
包含对包装过程有不利影响的序列,例如毒性基因(如促凋亡基因);破坏包装细胞或病毒的完整性(如导致细胞聚集的膜蛋白)的基因;易于重排或者产生二级结构的序列(如重复序列或者高GC含量序列)。
⽤户提供的载体,因为我们无法控制载体质量。
客户提供载体
如需客户提供AAV病毒载体,则请按照外来物品接收指南将载体寄送给我们。
请严格按照我们的指南来进行装运以免造成物品的任何延误和损坏。
客户提供的所有材料均需经过QC检测,每一份材料附加检测费用。
请注意,客户提供物品接收并通过QC之后生产才正式开始。
试验验证
我们开发了一系列专有技术用以优化三质粒转染法包装AAV的效率。
我们的病毒经过验证,在哺乳动物细胞中表现出很高的转导效率。
图1向HEK293T细胞转导18种血清型的重组AAV病毒,这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt)。
转导后48小时的EGFP表达效果如下图所示。
比例尺:100um。
图2向HeLa细胞转导18种血清型的重组AAV病毒,这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt)。
转导后48小时,EGFP的(A)荧光强度中值(MFI)和(B)细胞阳性率通过流式细胞术检测。
(C)不同血清型AAV的EGFP表达效果如下图所示。
比例尺:100um。
图3向Huh-7细胞转导18种血清型的重组AAV病毒,这些AAV病毒均使用CMV>EGFP载体(VB010000-9394npt)。
转导后48小时,EGFP的(A)荧光强度中值(MFI)和(B)细胞阳性率通过流式细胞术检测。
(C)不同血清型AAV的EGFP表达效果如下图所示。
比例尺:100um。
视频
暂无
文档
使用说明书
腺相关病毒体外应用
腺相关病毒体内应用
基因治疗专题
心脏研究专用AAV
神经研究专用AAV
肝脏研究专用AAV
肌肉研究专用AAV
COA
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常见问题解答
AAV病毒对比其他病毒载体有什么特点?▼
慢病毒
MMLV
腺病毒
AAV
组织嗜性
广泛
广泛
hAd5只感染表达CAR受体的细胞
取决于血清型
是否可感染非分裂细胞
是
否
是
是
病毒基因组稳定整合抑或游离于宿主基因组
稳定整合
稳定整合
游离的DNA附加体形式
游离的DNA附加体形式
滴度
高
中等
非常高
高
自定义启动子
是
否
是
是
应用
细胞培养和体内实验
细胞培养和体内实验
体内实验
体内实验
体内免疫反应
低
低
高
非常低
AAV病毒滴度是如何测定的?▼
我们通过裂解AAV病毒颗粒,然后以qPCR测定裂解产物中的AAV基因组拷贝数(ITR区域的拷贝数)来获取AAV的物理滴度(Physicaltiter)。
其他滴度测定方式如ddPCR、TCID50以选购方式提供。
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