腺相关病毒（AAV）包装相关注意事项 - 知乎专栏

病毒载体包装过程是及其复杂的，在做病毒包装实验时，科研工作者常常会遇到一些问题。

为了让大家在病毒包装实验过程少走弯路，针对病毒包装常见的问题 ... 首发于病毒包装无障碍写文章登录/注册病毒载体包装过程是及其复杂的，在做病毒包装实验时，科研工作者常常会遇到一些问题。

为了让大家在病毒包装实验过程少走弯路，针对病毒包装常见的问题为大家进行罗列提醒。

在病毒转染实验，该如何选择工具病毒一文中，我们有提到过腺相关病毒AAV的特性：进行AAV动物实验关键注意事项1.启动子的选择。

是选择广泛性启动子还是特异性启动子。

相比于血清型的组织特异性，特异性启动子可实现细胞的特异性，因此对特异性要求较高的研究，可以选择某种细胞特异性表达的启动子。

2.血清型的选择。

AAV的血清型主要由AAV衣壳蛋白的结构所决定，不同的衣壳蛋白结构识别不同的细胞表面受体，因此血清型的选择会影响AAV的感染效率、组织亲和性、和开始表达的时间。

3.病毒量及滴度。

根据不同的靶器官组织和所使用的不同AAV血清型（扩散能力不同），推荐注射的AAV量不同，传递到组织中的病毒颗粒数量对于感染效果影响很大。

但AAV使用量并不是越多越好，过多的量可能出现病毒溢出，而且根据我们的经验，病毒量太多有时候甚至会出现表达降低的情况。

想了解具体组织的病毒用量可以联系我们咨询。

4.注射方式。

对于可以进行局部注射的组织器官，采用局部多点注射靶器官可取得较好的特异性和表达效果；5.检测时间。

不同基因的表达高峰时间是不同的，再加上AAV需要从单链DNA变成双链DNA，一般在2周可检测到基因表达，如无抗体产生的影响，基因的表达可持续表达半年以上。

不建议用AAV做细胞转染实验的研究主要是因为AAV转染细胞的表达效率较低，且由于AAV是单链DNA，进入细胞后须经历一个由单链变成双链的过程才能进行转录翻译，而在没有辅助病毒或辅助因子的情况下，这种单链DNA复制形成双链DNA的过程十分缓慢，因此存在表达延迟的情况。

另外，体外细胞的生长速率较快，感染至细胞中的AAV会随着细胞分裂不断稀释，进一步导致其表达水平降低。

而在体内研究，注射的组织细胞通常不会有那么快的增殖，且各种AAV所携带的外源基因表达的因子较为丰富，因此表达丰度和持续的时间更好。

如何通过AAV实现体内的特异性表达由于目的基因在不同组织中功能不同，以及同一组织的不同细胞中功能也可能不同，所以我们实验过程中经常需要进行特异性表达。

AAV可通过以下几种方式实现体内的特异性表达：1.组织特异性血清型。

不同血清型的AAV具有不同的组织嗜性，因此首先要选择对特定组织感染能力强的血清型AAV。

2.（细胞）特异性启动子。

血清型主要利用侵染特异性，而启动子则是利用表达特异性，如某种特异性启动子AAV2，可侵染多种组织，但仅在某特定细胞表达。

3.局部注射。

此外还可采用Cre依赖性基因开关（Cre-loxp系统），如用特异性启动子含cre酶的AAV注射Loxp小鼠实现特定组织或细胞目的基因的敲除。

AAV的表达效果能持续多久AAV在细胞内主要是以环状的dsDNA附加体（circulariseddsDNAepisomes）的形式存在，而不会像慢病毒LV那样整合到宿主细胞的基因组。

对于分裂不旺盛的细胞，如神经元，AAV可持续表达1年以上甚至2年，对于分裂较旺盛的细胞，一般也可维持3~6个月或以上。

AAV作为体内实验常用工具病毒，能实现些什么功能1.基因过表达。

将目的基因的CDS区构建到AAV载体，注射到动物体内实现过表达2.目的基因的敲除。

将针对目的基因设计的gRNA和Cas9编码序列分别构建到AAV中，注射到动物体内实现基因敲除。

3.基因干扰表达。

将针对目的基因设计的shRNA构建到AAV载体，注射到动物体内实现干扰表达。

4.内源过表达。

将针对目的基因设计的gRNA和dCas9分别构建到AAV载体，实现内源过表达。

AAV转染后表达效果不理想1.载体表达效率低：更换启动子或增加强调控元件。

2.病毒量不够：应充分调研高分文献报道，确定AAV滴度及用量，对于找不到参考文献的，也欢迎咨询我们。

3.细胞负反馈机制：少数基因受上下游严格调控，这种情况较难实现过表达。

4.基因序列本身的元件：例如GC含量、隐蔽性剪接位点、转录终止信号和核酸二级结构等，也可影响表达。

因此，密码子优化广泛用于增强AAV中目的基因表达。

AAV动物实验，荧光表达弱荧光弱主要有2方面的原因，一是组织感染的效率较差，另外就是检测的正确性。

对于提高感染效率，则从病毒血清型是否合适、病毒使用量是否够、滴度是否合适，注射方法是否合理等方面进行分析；而对于检测，在组织样本切片制备的过程中，应考虑荧光蛋白的稳定性，如GFP遇酸容易淬灭等因素，从而确保检测的有效性。

另外，AAV病毒使用前需确认是否出现因储存不当而导致滴度下降的情况。

AAV的操作使用安全性怎么样迄今为止，未发现野生型AAV有致病性，实际上大部分人群都感染过AAV。

野生型AAV在无辅助病毒（如腺病毒）的存在下，复制效率非常低。

重组腺相关病毒（rAAV）由多个质粒（cis质粒、辅助质粒、rep/Cap质粒）组成，且Cis质粒、辅助质粒与rep/Cap质粒之间不具有同源性序列，因此重组AAV在理论上不具有复制的能力。

优势安全性：AAV是可供选择的最安全的病毒载体，它是复制缺陷的，不会引起任何人类疾病。

对宿主基因组造成破坏的低风险性：在转导进入靶细胞后，AAV病毒载体在细胞核保持着游离DNA的状态，可以降低宿主基因组被破坏而致癌的风险，使其成为人类体内实验的理想载体。

宿主范围广：针对不同来源的常用哺乳动物（如人、小鼠和大鼠）细胞和组织，将我们的AAV载体包装成对其具有亲和性的血清型，可轻易实现高效转导。

但是，某些类型的细胞仍然难以转导，这与所用的血清型有关。

不足之处载体容量小：AAV病毒载体系统装载量小。

AAV的两个ITR之间所能容纳的最大序列长度是4.7kb，允许使用者插入~4.2kb的目的序列。

难以转导特定类型的细胞：当利用合适的血清型进行包装时，AAV载体系统可以转导很多不同类型的细胞，包括非分裂细胞。

不同AAV血清型对不同类型的细胞具有不同的亲嗜性，针对某种特定类型的细胞需要特定血清型。

技术复杂：使用AAV病毒载体时，需要在包装细胞中产生活病毒，然后测定病毒滴度。

这些过程相对于常规质粒转染，技术难度更高，周期更长。

以上便是小编手机整理的AAV实验操作过程中常常会遇到的问题的处理方式，你的问题是否已经得到了解答？！编辑于2021-09-1116:20生物病毒细胞转染​赞同18​​4条评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​文章被以下专栏收录病毒包装