Lentivirus packaging | 慢病毒包裝- ACE Biolabs

某個基因如何影響癌症發展呢？抑制這個基因是否可以對抗癌症呢？實驗中常會需要探討某個基因的特定功能，最常用的方式就是透過慢病毒送入特定基因，可以是過量表現此 ... 首頁 CellCulture Lentiviruspackaging|慢病毒包裝2019/03/28 　　某個基因如何影響癌症發展呢？抑制這個基因是否可以對抗癌症呢？實驗中常會需要探討某個基因的特定功能，最常用的方式就是透過慢病毒送入特定基因，可以是過量表現此基因，或是透過RNAi系統削弱基因表現。

其優點在於製備相對容易，可以同時感染症在分裂以及未分裂的細胞，而且製備完的慢病毒只具有一次性感染力，感染的細胞無法再製作出慢病毒，因此相當地安全。

　　慢病毒為反轉錄病毒，現在的慢病毒系統大多是根據人類免疫缺陷病毒(HIV)，安全的原因在於去除了致病的基因部分，只取其重要的基因，並且分成數個質體。

第二代(secondgeneration)包裝系統是分成三個質體： 1.      包膜(envelope)質體負責表現病毒的VSV-G醣蛋白，有助於包膜的形成以及增加感染力。

2.      包裝(packaging)質體負責表現病毒RNA包裝所需要的蛋白質，包含Gag,Pol,Rev,Tat： 2.1.Gag負責產生病毒的蛋白質外殼，包住病毒RNA。

2.2.Pol會產生反轉錄酶(reversetranscriptase,RT)和整合酶(integrase,IN)，反轉錄酶負責將病毒RNA反轉錄成cDNA和將cDNA轉變成雙股DNA，而整合酶會將雙股DNA隨機嵌入宿主的染色體DNA中，成為宿主的一部分，所以慢病毒可以用來製作穩定表現基因的細胞株。

2.3.Tat會促進病毒的基因表現，增加轉錄的效率。

2.4.Rev負責將病毒mRNA轉移到細胞質中，幫助其轉譯和包裝。

第三代(thirdgeneration)包裝系統則是進一步將Rev拆成另一個質體，總共四個質體，具有更高的安全性。

3.   轉移(transfer)質體負責產生病毒RNA染色體，也就是我們要送入表現基因的質體。

在目標表現基因的兩端有LTR(longterminalrepeat)，這兩端特殊序列就是病毒包裝時的辨認區域，也是整合酶作用的區域。

原生的病毒所有的基因都會在這兩段之中，使得包裝出來的病毒擁有全部的重要基因，能夠在下次感染宿主時，再度表現所有的蛋白質，重新包裝出新的病毒顆粒。

而隨著這些基因被拆解到其他兩個質體，兩端LTR只剩下科學家們要研究的基因，因此製作出來的病毒雖然具有感染力，但是其RNA染色體卻沒有包含包裝用的基因，使得我們操作起來相對安全。

另外，除了研究目標基因，通常還會再加入報導基因(如螢光蛋白)和篩選基因(如puromycin抗性基因)，可以幫助觀察和篩選。

　　慢病毒可以用於短暫地基因表現，也可以用來製作穩定的細胞株(stableclone)，對細胞傷害很低，不會影響細胞正常的生理。

而慢病毒的包裝大抵可以分成三步驟：慢病毒包裝、慢病毒濃縮、效價測量。

一.  慢病毒包裝 包裝使用的細胞株通常選用HEK293T，此為高轉染效率細胞，培養液選用DMEM(10%FBS)，有些人建議添加其他營養物質，如sodiumpyruvate,NEAA,glucose,glutamine，不過實際上是否可以提高慢病毒產量需要實驗者自己確認。

另外，HEK293T細胞必須要處於健康的狀態，型態正常而且解凍繼代次數小於十次。

包裝的步驟為質體轉染和收集上清液。

質體轉染的步驟按照使用試劑的廠商說明，均勻混合質體和試劑後，加入細胞。

轉染完成後，大約於48-72小時會產生大量的慢病毒到細胞培養液中，因此只要收集上清液即可得到慢病毒。

建議可於48和72小時各收一次上清液。

使用3000g離心15分鐘去掉細胞殘餘之後即可進入濃縮步驟。

轉染需要注意的部分可分成細胞本身、質體以及轉染步驟： 1.    細胞： i.    細胞使用的培養液： 如同前面所述，不同的實驗室建議不同的添加成分，需要以實驗證明，不過大部分都會建議不要加入抗生素，如PS(penicillinandstreptomycin)，會降低病毒的活性。

ii.   轉染當下細胞的狀態： 通常是前一天種細胞，當天約六到八成滿，過少的細胞降低轉染的目標，過多的細胞則會抑制轉染的效率。

2.    質體； i.    質體的品質： 由於病毒包裝質體通常長度很長，超過10Kb，而且常會有重複的片段，建議使用適合大質體的勝任細胞放大質體，如Stbl3，可避免發生重組而使質體失去活性。

另外，質體的抽取放大應避免使用沉澱方式，而建議使用管柱的方式，增加純度。

ii.   質體間的比例： 三個(第二代)或四個(第三代)的質體之間會有特殊的比例，網路上可以找到一些人的建議，不過實驗室第一次使用時可以嘗試不同比例，找到最佳比例之後固定就可以了。

3.    轉染步驟： i.    轉染使用的混和液： 質體DNA和試劑混和時，血清會破壞試劑和質體DNA的交互作用，所以建議使用無血清的培養液混和試劑和DNA，有些廠商會直接提供反應的混和液，有些則建議使用Opti-MEM。

而混和好的試劑和DNA可直接加入含有血清的培養液中，不會受血清的影響。

ii.   質體試劑的比例： 基本上按照廠商建議，可以嘗試微調比例。

  二.  病毒濃縮 由於病毒顆粒非常微小，所以不容易沉澱下來，最早以前使用超高速離心來濃縮病毒，透過施加高重力的方式，才能夠沉澱出病毒顆粒。

但是因為超高速離心機較為昂貴，並不是每個實驗室都會擁有，所以後來研發出PEG沉澱法和層析法。

所有操作病毒過程盡量置於低溫冰上，濃縮完的病毒分裝後存放於-80度，盡量避免反覆解凍。

1.    超高速離心： 離心步驟設定110,000g3-4小時。

通常會搭配其他介質提高病毒純度，最簡單的就是蔗糖溶液，由人工配置不同濃度的蔗糖溶液，從高濃度開始依序加入離心管中，形成一濃度梯度，最後放入病毒溶液。

超高速離心作用之下，病毒顆粒會緩慢下降，直到密度相等的介質中，此方法可以得到高純度的病毒液，不過麻煩的是濃度梯度的建構和最後提取病毒層的困難度。

也可以使用單層的高濃度蔗糖溶液(15-20%)，那麼病毒就會沉澱到最下層，操作起來較為方便。

2.    PEG沉澱法： PEG(polyethyleneglycol)為水溶性的非離子性聚合物，一般使用分子量2000-8000的PEG。

另外會添加NaCl，在高鹽濃度下，病毒顆粒會吸附在PEG上，只要低重力的離心(5000g兩小時)即可沉澱病毒顆粒。

PEG濃度為3-10%，而NaCl為0.3-0.8M，混合好PEG和NaCl的病毒液需要於4度反應過夜。

此方法最大的好處在於簡單和便宜，實驗室可以自行操作，缺點是需要一個晚上的反應時間。

3.    層析法： 層析法最大的好處在於可以一次處理較多的病毒溶液，缺點是必須使用高離子濃度或改變酸鹼度沖洗病毒下來，容易降低病毒的活性。

可以使用陽離子交換管柱層析法和親合層析法，前者是透過病毒表面的正電荷吸附在管柱上，後者則是透過抗體的方式結合病毒表面蛋白。

不過層析法大部分都還在實驗室階段，市面上不容易取得。

  三.  病毒效價測量 病毒效價測量可透過檢測病毒本身的RNA或蛋白質含量，或是實際感染細胞檢測報導基因或是抗生素抗性基因表現。

1.    檢測病毒RNA： 此方法是藉由即時定量聚合酶連鎖反應(qPCR,real-timePCR)偵測病毒RNA的含量。

藉由針對LTR的引子，加上已知濃度的標準品一起進行反應，由標準品和樣本的CT(thresholdcycle)差距推估樣本的RNA含量。

此方法簡單快速而且可以一次檢測多個樣本。

SYBR試劑可以參考2XACESYBR®qPCRMasterMix(ACEBiolabs,EP2016)。

2.    檢測病毒蛋白質： 此方法是由抗體偵測病毒表面蛋白質的含量(capsid)，現在市面上有15分鐘即可完成的快篩，或是4-6小時的ELISA。

快篩方式是類似驗孕片的機制，最後產生出一條色帶，由顏色深淺判斷病毒含量，此方法雖然快速，但是只能粗略估計。

而ELISA法雖然耗時較長，但是透過和標準品的比對，可以有比較精確的結果。

抗體的使用可以放大訊號，可以大幅度地降低偵測極限。

3.    實際感染細胞： 偵測病毒RNA或蛋白質的方法雖然快速(一天內完成)，但是只能知道總體病毒顆粒的數目，無法得知「具有感染力」的病毒顆粒數目，因此需要實際感染細胞。

具有報導基因的轉移質體可以透過偵測螢光細胞的數目，計算出病毒感染力，螢光細胞數目除以病毒給予體積即可得到結果。

而具有篩選基因的轉移質體則比較複雜，必須給予細胞不同體積的病毒，以抗生素篩選後，以未被感染和未加抗生素的細胞當作100%，計算出相對存活率，再找出線性區域推算出固定體積的病毒液可以感染多少細胞。

細胞存活的數目測量可以使用CCK-8CellCountingKit(ACEBiolabs,CC1007)。

　　慢病毒包裝三個流程並沒有太大困難，包裝步驟關鍵在於質體本身的品質和比例，需要實驗室多加試驗。

而濃縮步驟最大的問題在於，不論是透過何種方法，多少都會降低病毒的活性，實驗者需要找到最適合自己實驗室的方法。

而效價測量的方法各有好壞，快速的方法比較不精準，而精準的方法需要長時間實驗，實驗者需要視情況選擇最好的方法。

最後就是雖然慢病毒相對一般病毒而言安全許多，不過還是要特別注意，小心病毒液沾染到實驗器具，以及操作時需要穿戴手套。

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