以MARCM标记单细胞在果蝇神经系统的应用 - Bio-protocol

MARCM的作用原理是当母细胞(parental cell) 的同源染色体经由FRT发生染色体重组(homologous chromosome recombination)，经细胞分裂后即有机会产生一个不 ... 中文 Home Protocols Researchfields Biochemistry  (1155) Biophysics  (89) CancerBiology  (367) CellBiology  (1697) DevelopmentalBiology  (250) Immunology  (513) Microbiology  (994) MolecularBiology  (903) Neuroscience  (538) PlantScience  (917) StemCell  (200) SystemsBiology  (257) Bio-protocoljournal Specialissues Labprotocolhub RequestaProtocol Submit Submitaprotocol Authorguidelines About | Protocols  Researchfields  Biochemistry  (1155) Biophysics  (89) CancerBiology  (367) CellBiology  (1697) DevelopmentalBiology  (250) Immunology  (513) Microbiology  (994) MolecularBiology  (903) Neuroscience  (538) PlantScience  (917) StemCell  (200) SystemsBiology  (257) Bio-protocoljournal Specialissues Labprotocolhub RequestaProtocol Submit  Submitaprotocol Authorguidelines About Abriefversionofthisprotocolappearedin: SimilarProtocols 小鼠脑组织冰冻切片 小鼠脑切片原位杂交 ReproducibilityFeedback    Shareyourfeedback NavigatethisArticle   LabelingSingleCellsbyMosaicAnalysiswithaRepressibleMaker(MARCM)inDrosophilaNervousSystem    张颢馨周雅惠 张颢馨Affiliation:细胞与个体生物学研究所/中央研究院,台北市,台湾    Gotoauthorpage周雅惠[email protected] Affiliation:细胞与个体生物学研究所/中央研究院,台北市,台湾    Gotoauthorpage DOI:   10.21769/BioProtoc.1010289 Published:  June20,2019 Views:4004 DownloadPDF DownloadPDF OriginalVersion OriginalVersion UpdatedVersion UpdatedVersion Howtocite Favorites Q&A Shareyourfeedback Citedby 引用格式：张颢馨,周雅惠.(2019).以MARCM标记单细胞在果蝇神经系统的应用.Bio-101:e1010289.DOI:10.21769/BioProtoc.1010289.Howtocite: Chang, H.H.andChou,Y.H.(2019).LabelingSingleCellsbyMosaicAnalysiswithaRepressibleMaker(MARCM)inDrosophilaNervousSystem.Bio-101:e1010289.DOI:10.21769/BioProtoc.1010289. 摘要：在以果蝇为实验材料的研究中，常利用Mosaicanalysiswitharepressiblemaker(MARCM)标记单个或一群细胞，以观察神经细胞的形态(morphology)或操控基因的表达。

MARCM的作用原理是当母细胞(parentalcell)的同源染色体经由FRT发生染色体重组(homologouschromosomerecombination)，经细胞分裂后即有机会产生一个不带有GAL80的子细胞，而使得GAL4得以作用。

因为这项技术可标记特定细胞谱系中的单个或一小群细胞，因此适合用于研究细胞谱系、神经回路以及探讨特定基因在神经细胞或其他组织中的功能。

关键词:果蝇(Drosophila),MARCM,单细胞克隆(single-cellclone),多细胞克隆(neuroblastclone),神经节母细胞(ganglionmothercell) 材料与试剂 500μl微量离心管(Eppendorftubes)(Axygen,catalognumber:MCT-060-C) 载玻片(SuperFrostTMMicroscopeSlides,Ground45°,76×26mm)(ThermoScientificTM,catalognumber:10281711) 盖玻片(coverglassesthicknessNo.1,22×22mm)(MarienfeldSuperior,catalognumber:0101050) 移液枪头(移液枪配套使用)[Axygen,catalognumber:14-222-436(1,200μl),14-222-437(200μl),14-222-438(10μl)] 培养皿(AlphaPlus,55×15mm,catalognumber:PP3-55) 果蝇 果蝇管(信德仪器有限公司，catalognumber:PT10-30100) EmbryoCollectionCage-Small(GeneseeScientific,Flystuff,catalognumber:59-100) 透明指甲油(露华浓经典指甲油，Revlon，catalognumber:Vernis771) 葡萄果汁(味全公司，每日C100%葡萄综合果汁) 琼脂(agar)(GeneTeks,catalognumber:WGT-PA001) 二次过滤水(ddH2O) 95%酒精(景明化工股份有限公司) 冰醋酸(glacialaceticacid)(Sigma-Aldrich,catalognumber:JT-9508) 丙酸(proprionicacid)(Sigma-Aldrich,catalognumber:SI-P1386-1L) CO2(板桥气体有限公司) 活性干酵母发酵粉(RedStar,activedryyeast) 聚甲醛(20%paraformaldehyde)(ElectronMicroscopySciences,catalognumber:15713-S)  10×磷酸盐缓冲生理盐水(10×Phosphatebufferedsaline(PBS))(UniRegionBio-Tech,catalognumber:UR-PBS001-1L)  山羊血清(NormalGoatSerum)(JacksonImmunoResearchLaboratories,catalognumber:005-000-121) TritonX-100(Sigma-Aldrich,catalognumber:X100) SlowFadeTMGoldAntifadeMountant(Invitrogen,catalognumber:S36936) 1×PBS(磷酸盐缓冲生理盐水)(见溶液配方) 4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水(见溶液配方) PBST(3%TritonX-100/PBS;1,000ml)(见溶液配方) 5%山羊血清(NormalGoatSerum)(见溶液配方) 第一抗体溶液(见溶液配方) 第二抗体溶液(见溶液配方) 仪器设备 镊子(Dumont#5Forceps)(DumontSwitzerland,catalognumber:11252-20) 1,000ml烧杯(Pyrex,catalognumber:1000-1L) 微量移液枪(Pipetman)[Gilson,P1000(F123602),P200(F123601),P20(F123600),P2(F144801)] 解剖显微镜(Nikon,model:N-SMZ745) 共轭焦显微镜(Zeiss,model:LSM780) 培养箱(Firstek,model:RI-560) 恒温水槽(Firstek,model:B-102) 3D旋转震荡器(Digisystem,model:SR-100) 4°C冷藏柜(JunYang,model:JR-2-1100) 微波炉(Panasonic,model:NN-ST340) 实验步骤 用来进行MARCM的果蝇必须具备以下几个元素：(1)GAL4及UAS-reporter(如UAS-GFP)，以用于标记要研究的细胞；(2)tubp-GAL80，以抑制GAL4在所有细胞的作用；(3)flippaserecombinase(FLP)及FLPrecombinationtarget(FRT)，在处于G2-M细胞周期细胞中，经由FLP作用在同源染色体的两个同向FRT位置而造成染色体互换，进而使GAL80只存于一个子细胞中，而另一个子细胞则因不带有GAL80，而使得GAL4可启动UAS下游基因的表达(图1A)。

一般最常用的FLP是利用热激(heatshock)以诱导hs-FLP之启动子(promoter)活化并表达FLP。

    本实验方法中，以果蝇第一型神经细胞谱系(Type1celllineage)为例来说明MARCM克隆的类型。

在发育过程中，每一细胞谱系会从单一一个神经母细胞(neuroblast)开始进行第一次细胞分裂，而产生1个神经节母细胞(ganglionmothercell)和1个新的神经母细胞。

此神经节母细胞会再进行一次分裂而产生2个神经细胞(neurons)或产生1个神经细胞及1个神经胶质细胞(glia)，而新的神经母细胞会再进行下一次分裂，而产生另1个神经节母细胞和新的神经母细胞(图1B)。

    在细胞谱系持续进行细胞分裂时，FLP作用在不同的细胞会标记不同的株落。

若FLP表达在神经节母细胞而造成同源染色体互换，此结果会使GAL80只表达于1个子细胞中，所以另一个子细胞中的GAL4就没有GAL80的抑制，因此将只有单一神经细胞被标记(单细胞克隆；single-cellclone)。

若FLP表达在神经母细胞而造成同源染色体互换，而GAL80则只表达于新的神经母细胞中，此时神经节母细胞的GAL4将没有GAL80抑制，因此可标记双细胞克隆(two-cellclone)。

同理，若是在神经母细胞分裂时表达FLP，而GAL80则只表达于神经节母细胞中，此时新的神经母细胞中的GAL4将没有GAL80抑制，因此可标记多细胞克隆(neuroblastclone)(图1B-C)(Theodosiou和Xu,1998;Lee和Luo,1999;Wu和Luo,2007)。

图1.MARCM原理.A.MARCM原理及示意图。

GAL4作为转录因子，其会作用在结合位点UAS上，而启动其下游基因(如GFP)的表达。

GAL80是抑制因子，其会抑制GAL4的活性而使其无法作用在UAS。

在MARCM的方法中，母细胞带有GAL4，UAS-GFP，FRT及FRTtubp-GAL80(A1)(Lee和Luo,1999)。

经过S细胞周期，染色体会复制形成2n(A2)。

若在G2-M细胞周期时，诱导这个细胞表达FLP，随之FLP会作用在两个FRT序列上，使其发生基因重组(A3)(Theodosiou和Xu,1998;Wu和Luo,2006)。

细胞分裂后，其中一个子细胞可能不带有GAL80，因此其便可表达GFP(A4)。

B.MARCMclone示意图。

在果蝇的第一型细胞谱系(Type1lineage)，神经母细胞(Nb)会分裂成神经节母细胞(G)和新的神经母细胞，而神经节母细胞会再分裂而产生2个神经细胞(N)。

若在神经节母细胞分裂前发生染色体互换，则其中一个子细胞可能不带有GAL80，故可检测到单细胞克隆(single-cellclone，上图)；若在神经母细胞分裂前发生染色体重组，则会有两种可能：一是产生的神经节母细胞不带有GAL80，从而产生双细胞克隆(two-cellclone，中图)，二是产生的神经母细胞不带有GAL80，从而造成多细胞克隆(neuroblastclone，下图)。

C.共轭焦显微镜影像的果蝇大脑范例图。

(上图)单细胞克隆、(中图)双细胞克隆、(下图)多细胞克隆。

D.非MARCMclone范例图。

(左图)原始GAL4(OK107-GAL4)之表达；(右图)标记细胞之数量与原GAL4相似(详见结果与分析)。

一、葡萄汁琼脂盘制作 (以制备350ml葡萄汁琼脂混合液为例)将168ml葡萄汁、160ml二次过滤水和13.44g琼脂倒入1,000ml烧杯(或烧瓶)中，并置于微波炉中加热至溶解。

注：必须分段加热，以防止液体瞬间沸腾而溢出烧杯。

将混合液置于室温至稍微冷却后(约75°C)，加入3.5ml95%酒精、3.35ml冰醋酸和1.75ml丙酸，并用手轻微摇晃烧杯使其混合均匀。

将混合液倒入培养皿中，每一培养皿加入约28ml的混合液(约可制备12个葡萄汁琼脂盘)。

将葡萄汁琼脂盘置于室温冷却至凝固后即可以使用。

未使用的的葡萄汁琼脂盘可用经二次过滤水沾湿的吸水纸将其包住，置于保鲜盒密封，并储存于4°C冷藏柜，保存期限约1个月。

二、标记特定出生时间的神经细胞 准备带有产生MARCM所需基因的果蝇： 例如：将未交配过的雌果蝇(UAS-mCD8GFP,hsFLP/FM6;FRTG13/CyO)与雄果蝇(FRTG13,tubp-GAL80/CyO;Elav-GAL4/TM6B,Tb)交配，便可得UAS-mCD8GFP,hsFLP/+;FRTG13/FRTG13,tubp-GAL80;Elav-GAL4/+子代以用于MARCM实验。

在果蝇管中洒入活性干酵母发酵粉后，放入约50只尚未交配的雌果蝇和10只雄果蝇，使其在25°C培养箱交配约2~3天。

果蝇的虫龄以0~7天为佳。

第3天，将活性干酵母发酵粉洒在葡萄汁琼脂盘上并将果蝇移至组装好的Cage和琼脂盘(图2B,2C)，接着将整组置于25°C培养箱，使果蝇在葡萄汁琼脂盘上产卵。

放入培养箱16小时，以产出足够数量的卵(其中多数仍为尚未孵化的卵)。

之后将果蝇亲代用CO2麻醉，并移至一组新的cage或果蝇培养管。

在解剖显微镜下检查琼脂盘上是否有幼虫孵出，并用镊子将盘上已经孵出的幼虫(图2C)移除。

再将此旧的琼脂盘与cage组好并置于25°C培养箱。

(以设计收集12小时间出生的神经细胞为例)距前次去除幼虫12小时后，将葡萄汁琼脂盘上已经孵出的幼虫用镊子挑至果蝇培养管中，此时幼虫的年纪范围为孵化后0~12小时(0~12hafterlarvalhatching,ALH)(图2A,2C)。

将此带有幼虫的果蝇培养管置于25°C培养箱。

(以透过MARCM标记在孵化后36~48小时出生之神经细胞为例)在25°C培养箱继续培养36小时，管中幼虫的虫龄为36~48hALH。

此时将幼虫置于37°C恒温水槽1小时(图2A,2C)。

这个方法原则上会使幼虫所有细胞因热感应而表达Flipase。

因为MARCM造成的染色体互换只会发生在处于G2-M细胞周期的细胞，故在此实验中被标记的神经细胞的出生时间为36~48hALH。

若要标记孵化后12~24小时的幼虫之神经细胞，则在挑出0~12hALH的幼虫(实验步骤5)后，在25°C培养箱继续培养12小时，再将培养管至于37°C恒温水槽1小时以促使细胞表达Flipase。

可以此类推欲标记出生时间的神经细胞(图2A,2C)。

待温水浴后，将果蝇培养管放回25°C培养箱，静待幼虫生长至成蝇。

图2.以MARCM标记特定时间出生的果蝇神经细胞的实验设计.A.果蝇发育时间范例。

本范例的时间间隔(timewindow)是12小时，从幼虫孵出后至成蝇羽化前共分成16个时间间隔，收集不同时间间隔的果蝇幼虫或蛹并诱导细胞表达FLP，便可能标记到在该时间间隔出生的神经细胞。

B.EmbryoCollectionCage的组装。

(左图)组装前零件的俯视图；(中图)组装前Cage的侧面图及洒上活性干酵母粉的葡萄汁琼脂盘的俯视图，建议如图示的酵母粉密度并只洒在约1/3的面积；(右图)组装后的侧面图。

C.标记特定时间出生的果蝇神经细胞实验流程图。

星号(*)：要去除之幼虫。

白色箭头：还未孵化的卵。

白色箭号：要收集至果蝇管之幼虫，此时收到的幼虫年龄为孵化后0~12小时。

三、果蝇大脑的免疫染色 实验前新鲜配制4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水(4%paraformaldehye/PBS)，在500μl微量离心管中加入500μl4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水，再将其置于碎冰上。

  收集羽化后2~5天的成蝇，在新鲜配制的4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水中进行解剖以获取成蝇的大脑，并将解剖出的成蝇脑立即放入冰上的微量离心管。

此离心管在整个解剖过程中必须固定在碎冰上，以保持成蝇脑的新鲜程度。

解剖完所有样本后，将离心管移至室温下，置于3D旋转震荡器水平均匀反应20分钟。

用微量移液枪移除离心管中的聚甲醛，并在离心管中加入500μl含0.3%TritonX-100的磷酸盐缓冲生理盐水混合溶液(0.3%TritonX-100/PBS;PBST)。

而后将此微量离心管置于3D旋转震荡器并在室温下均匀反应20分钟，以移除残留在果蝇大脑的聚甲醛。

反应后将微量离心管中的PBST移除，并加入新的PBST再次清洗。

重复以PBST清洗样品共3次。

移除微量离心管中的PBST，并在离心管中加入400μl5%山羊血清(normalgoatserum)，置于3D旋转震荡器并在室温下反应30分钟，以降低抗体非专一性的结合。

移除5%山羊血清，并在微量离心管中加入400μl第一抗体(primaryantibody)溶液。

将离心管置于冷藏柜中的3D旋转震荡器中，使样品在4°C均匀反应至少二个隔夜(twoovernights)。

用微量移液枪移除离心管中的第一抗体溶液，再加入500μlPBST，将离心管置于3D旋转震荡器并在室温下反应20分钟，以PBST清除残留以及未与抗原结合的抗体。

反应后将离心管中的PBST移除，并加入新的PBST再次反应。

前后共以PBST清洗样品3次。

移除离心管中的PBST，并在离心管中加入400μl第二抗体(secondaryantibody)溶液。

将离心管置于4°C冷藏柜中的3D旋转震荡器中，使样品在4°C均匀反应至少一个隔夜(oneovernight)。

以微量吸管移除离心管中的第二抗体溶液，并在离心管中加入500μlPBST，将离心管置于3D旋转震荡器并在室温下反应20分钟，以PBST清除残留以及未与抗原结合的抗体。

反应后将离心管中的PBST移除，并加入新的PBST再次反应。

前后共以PBST清洗样品3次。

移除离心管中的PBST后，在离心管中加入SlowFadeTMGoldAntifadeMountant以降低荧光褪色速度。

将样品至于4°C冷藏柜至少一个隔夜，以使AntifadeMountant与组织中的PBST得以充分置换。

  将盖玻片(coverglassesthicknessNo.1,MarienfeldSuperior)压碎成0.5×0.5mm的碎片，将一200μl微量吸管(yellowtip)的尖端剪掉，再以此微量吸管将果蝇的脑连同少量AntifadeMountant从离心管中吸出，置于以酒精清洁过的载玻片上，并在样本周围四个角落以碎盖玻片作为支撑，使盖玻片覆盖样本时不会挤压到果蝇的大脑。

最后以指甲油密封盖玻片的外围。

结果与分析 MARCMclones的判读 在幼虫被置于37°C恒温水槽1小时的时间断内，并非所有的细胞皆处于G2-M细胞周期，因此相较于只以GAL4标记神经细胞的大脑，在带有MARCMclones的大脑中，表达GAL4的神经细胞数量应该会少非常多。

最常见的二种异常情况为： 1) 所有大脑样品皆没有标记到任何细胞：此情形常因为果蝇未带有FLP,FRT,GAL4或UAS-reporter中任一项或数项。

然而，也有可能是在37°C恒温水槽1小时的培养时间太短，而不足以促使足够的FLP表达，或是置于37°C恒温水槽的时间点未涵盖到欲观察的细胞进入G2-M的时间。

2) 标记的神经细胞的数量与GAL4表达相似(图1D)：此情形常因果蝇未带有tubp-GAL80。

三种类型MARCMclone机率(clonefrequency)的计算 1) 通过计算某一特定类型clone的发生机率，可推算果蝇神经发育过程中的不同时间点，神经母细胞或神经节母细胞的分裂速度，以及神经细胞的产生速度。

例如幼虫孵化后12~24小时，假设其出现单细胞克隆的机率相较于其它时间点较低，且多细胞克隆出现的机率较高，则可推测12~24小时这段时间内神经节母细胞可能处于不分裂的状态，因而标记单细胞克隆的机率较低。

以下说明计算三种clone发生机率的方法：以单细胞克隆的发生机率为例，以半脑(单侧的大脑)为单位，clone发生机率=(带有单细胞克隆的半脑数)/(总样本半脑数)。

2) 当FLP表达在神经母细胞而造成染色体重组时，其结果会使GAL80只表达于产生的神经节母细胞或新的神经母细胞，理论上这样的机率是50:50。

因此，双细胞克隆和多细胞克隆的clone发生机率理论上应该会一样或相近。

失败经验 使用的抗体的组合及浓度必须事先测试，否则可能会因免疫荧光染色状况不佳，而误判为没有MARCM克隆，或是导致不能观察到GAL4表达较少的克隆的情形。

溶液配方 1×PBS(磷酸盐缓冲生理盐水) 用二次过滤水稀释10×PBS至1×PBS，可放置于室温，一般可储存数个月，但视环境而异 4%聚甲醛/磷酸盐缓冲生理盐水 以1×PBS稀释20%聚甲醛至4%聚甲醛溶液，放置于碎冰上，使用当天配制 PBST(3%TritonX-100/PBS,1,000ml) 3mlTritonX-100 100ml10×PBS 897ml二次过滤水 须充分搅拌均匀，一般可放置于室温数月，但会因环境而异，必须注意是否有霉菌生长，一但发现霉菌，必须立即丢弃 5%山羊血清(NormalGoatSerum) 以1×PBST稀释normalgoatserum至5%，放置于碎冰上，需于使用当天配制 第一抗体溶液 用5%山羊血清(溶液配方4)稀释第一抗体至特定浓度(每种第一抗体适合的浓度不同)，放置于碎冰上，使用当天配制 第二抗体溶液 以1:500用PBST稀释，放置于碎冰上，使用当天配制 致谢 本研究方法首先于Lee和Luo(1999)描述。

感谢蔡国鼎与刘南甫于本文撰写过程所提供的宝贵建议。

本研究方法是由中央研究院前瞻计划(AS-102-CDA-L02)经费支持。

本研究方法无任何利益冲突或竞争性利益。

参考文献 Lee,T.andLuo,L.(1999).Mosaicanalysiswitharepressiblecellmarkerforstudiesofgenefunctioninneuronalmorphogenesis.Neuron22(3):451-461. Theodosiou,NAandXu,T.(1998).UseofFLP/FRTsystemtostudyDrosophiladevelopment.Methods14(4):355-365.  Wu,J.S.andLuo,L.(2006).Aprotocolformosaicanalysiswitharepressiblecellmarker(MARCM)inDrosophila.NatProtoc1(6):2583-2589. Pleaseloginorregisterforfreetoviewfulltext Viewfulltext DownloadPDF Q&A Copyright: © 2019 TheAuthors;exclusivelicenseeBio-protocolLLC. 引用格式：张颢馨,周雅惠.(2019).以MARCM标记单细胞在果蝇神经系统的应用.Bio-101:e1010289.DOI:10.21769/BioProtoc.1010289.Howtocite: Chang, H.H.andChou,Y.H.(2019).LabelingSingleCellsbyMosaicAnalysiswithaRepressibleMaker(MARCM)inDrosophilaNervousSystem.Bio-101:e1010289.DOI:10.21769/BioProtoc.1010289. Categories Neuroscience > Basictechnology Q&A Ifyouhaveanyquestions/commentsaboutthisprotocol,youarehighlyrecommendedtoposthere.Wewillinvitetheauthorsofthisprotocolaswellassomeofitsuserstoaddressyourquestions/comments.Tomakeiteasierforthemtohelpyou,youareencouragedtopostyourdataincludingimagesforthetroubleshooting. Ifyouhaveanyquestions/commentsaboutthisprotocol,youarehighlyrecommendedtoposthere.Wewillinvitetheauthorsofthisprotocolaswellassomeofitsuserstoaddressyourquestions/comments.Tomakeiteasierforthemtohelpyou,youareencouragedtopostyourdataincludingimagesforthetroubleshooting. AllField Findoutmore Weusecookiesonthissitetoenhanceyouruserexperience.Byusingourwebsite,youareagreeingtoallowthestorageofcookiesonyourcomputer.