mRNA合成|In Vitro Transcription并非想象的那么简单 - 知乎专栏

转录的基本原理. 在转录起始位点（the start site of transcription）上游，有一段保守启动子序列（consensus promoter sequence）。

首发于mRNAFactory无障碍写文章登录/注册原文首发于Biofactory撰文|留胡子的豆腐在新冠疫情带来的梦魇中，mRNA疫苗凭借高效的保护力，快速的产能放大，一飞冲天，让人们看到终结疫情的希望。

同时，在人身上大规模接种mRNA疫苗也提供了海量的临床数据，证实了其安全性，为各种各样的mRNA-baseddrug应用于真实世界，打下坚实的基础。

资本闻风而动，涌向整个核酸行业，催生明日之星。

mRNA药物生产工艺不仅路线非常明确成熟，而且在应对各种各样的靶标mRNA时，工艺路线固定不变。

不像抗体药物，不同的抗体需要摸索不同的纯化工艺路线。

一旦整个生产线搭建运转起来，基本上靠化学合成来完成，非常容易扩大生产。

我们只需合成遗传信息指令即可,把苦活累全部活交给人体细胞自己去完成。

关于mRNA药物生产工艺的文章，网上大把，但是细节解析几乎没有，因此笔者会持续挖掘一些有价值的信息，加以分享，让读者大人可以从同质化的公众号文章（那些整天别人翻来覆去转发，毫无任何价值，浮于表面的垃圾信息）中脱身出来。

RNA合成RNA合成可以分为固相化学合成和酶法合成。

SolidPhaseChemicalSynthesis固相化学合成适用于一些短链RNA合成（50-100nt）。

不足的地方在于，随着RNA的长度增加，合成产量和纯度会发生下降。

申基生物研发人员称，他们可以采用固相化学合成mRNA的长度达到150bp，如果去掉20bp的polyA尾巴，此150bpmRNA可编码产生40个氨基酸的多肽序列。

此类短肽的mRNA序列可以用于表达抗原表位肽，进行疫苗研发。

EnzymaticSynthesis适用于各种长度RNA,实现高产量，还得靠酶学的方法。

酶法合成利用T7RNApolymerase，通过体外转录反应来实现高产量的各种长度的RNA合成。

T7RNApolymerase在体外也具有有启动子特异性的转录活性（promoterspecifictranscription），是第一个被鉴定出来的单亚基RNApolymerase，可在大肠杆菌种过表达，用于构建体外转录系统。

早在八十年代左右，人们就把外源目的基因连到质粒上，提取质粒，酶切得到线性化的模板，以此线性化的质粒模板来合成RNA。

转录的基本原理在转录起始位点（thestartsiteoftranscription）上游，有一段保守启动子序列（consensuspromotersequence）。

RNApolymerase识别并且结合到特异性的启动子上（recognizesandbindsspecificpromoter），打开（melt）转录起始位点附近的DNA双链，启动RNA的从头合成（initiatedenovosynthesisofRNA）。

RNApolymerase利用NTPs起始转录，初始阶段，转录是不稳定低效的，典型特征是重复发生流产性起始事件（characterizedbyrepeatedabortiveinitiationevents），形成长度2-6nt流产短链RNAs（shortabortiveRNAs）。

一旦合成出超过10-12ntRNA，RNApolymerase构象发生改变，逃离启动子，DNA-酶-RNA形成稳定的三元复合物，进入高效转录阶段（entersthehighlyprocessiveelongationphase），直到RNApolymerase遇到终止子（aterminatorsequence）或者从线性DNA模板（the5′endofalinearizedtemplate）的末端滑落掉下,mRNA转录合成便终止。

T7RNApolymeraseStructure细胞和叶绿体的RNApolymerase由多个不同的亚基组成，不同的亚基执行不同的功能。

许多噬菌体和线粒体的RNApolymerase由单一的亚基构成，同时拥有多种功能，比如RNA的聚合，DNA双链的解开，DNA-RNA链的解开。

T7RNAP主要32个ɑ螺旋和9个β折叠片构成。

C端结构域有2/3跟Klenowfragment相似，由finger，thumb，palm，组成，N端结构域（1-325）是T7RNApolymerase特有的，涉及启动子识别和DNA解链。

T7RNApolymerase可以解开-1to-4的碱基对，该区域的模板链置于含有催化活性位点的裂缝区域（catalyticactive-sitecleftofthepolymerase），形成一个transcriptionbubble。

在promoterDNA双链邻近的大小沟，T7RNApolymerase来实现启动子双链区域的序列特异性识别。

Intercalatingβhairpin（230-240）插入到DNA大沟里，实现碱基的直接识别。

由740-770残基形成specificityloop同样可以识别碱基对。

N端结构域通过插入一段弹性的loop结构(93-101)来识别DNA小沟中富含AT碱基的DNA序列(-17——13)。

转录初始和延伸阶段，在构象上，T7RNApolymerase有由非常显著的差异。

DNA-T7RNApolymerase在延伸阶段非常稳定。

T7lysozyme可以抑制T7RNApolymerase从初始阶段向延伸阶段的转变，但是对于转录延伸阶段的T7RNApolymerase活性没有任何的影响。

从转录初始进入到延伸阶段以后，T7RNAP的N端结构域发生重排，破坏掉启动子结合结构域，创造出一个可以容纳7bpDNA-RNA异质性双链的通道，在异质性双链脱落以后，允许RNA转录本通过。

PromoterDependentPolymeraseT7RNAploymerase同时有依赖于DNA模板和RNA模板的RNA聚合酶活性，可以高度特异性地识别保守启动子序列，但其聚合酶活性具有非常大的弹性尺度范围。

不管双链DNA启动子序列后面跟着的是双链or单链DNA序列，双链or单链RNA序列，chemericDNA-RNA,T7RNAploymerase都可以启动转录合成RNA序列，这可以看作是T7RNApolymerase依赖于启动子的聚合酶活性（promoterdependentpolymerase）。

说白了，只要存在启动子DAN双链序列，不管后面接的是什么，T7RNAploymerase都可以利用NTPs合成出产物RNA。

PromoterIndependentPolymerase有研究利用RNA-Seq来研究体外转录反应产物序列和产量分布情况，发现IVT反应中的RNA产物末端可以折回形成发卡结构，将自身变成引物，在3'端添加NTPs，产生长度超过预期产物的RNA，并且随着RNA产物浓度的升高，此过程会跟以DNA为模板的正常转录过程发生竞争。

以上过程，可以看作是独立于启动子序列的聚合酶活性（promoterindependentpolymerase）。

说白了，就是IVT反应的产物RNA可能会自己折叠形成发卡结构，把自己变成RNA引物，并且以自己为模板在末端添加核苷酸，这样的话就产生了很多超过预期长度的产物RNA。

这个过程可能会循环发生，导致更长的RNA产物反而成了IVT反应的主要产物。

副产物给mRNA纯化增添困难T7RNApolymerase在体外转录反应中，不仅可以产生符合预期长度的mRNA(expectedrunoffRNAproducts),还会产生一些副产物RNA(contaminantRNA),比如短的流产RNA（n-i），甚至更长的RNA（n+i）。

IVT反应中，这些副产物增加了纯化目标mRNA的难度。

IVT反应副产物RNA可能形成的dsRNA,会导致机体产生强烈的免疫反应，因此必须去除dsRNA。

目前mRNA主流纯化工艺都是采用oligodT柱子（只选择性地结合有polyA尾巴RNA），高盐浓度下，可以抑制携带负电荷的柱子配体和RNA之间的相互排斥，促进氢键形成。

将盐离子去除以后，恢复柱子配体-RNA之间的负电荷之间的排斥，摧毁氢键，把RNA洗脱下来。

总结IVT反应本身没有难度可言，但是如何实现产量的最大化，如何减少副产物的形成，如何实现高效的加帽率，如何得到高纯度的mRNA,这些都是需要从业人员一一去攻克的难关路漫漫其修远兮，愿我们上下而求索，建立起高产量高效率的mRNA合成纯化路线。

参考文献：1.Arnaud-BarbeN,Cheynet-SauvionV,OriolG,MandrandB,MalletF.TranscriptionofRNAtemplatesbyT7RNApolymerase.NucleicAcidsRes.1998;26(15):3550-3554.2.GholamalipourY,KarunanayakeMudiyanselageA,MartinCT.3'endadditionsbyT7RNApolymeraseareRNAself-templated,distributiveanddiverseincharacter-RNA-Seqanalyses.NucleicAcidsRes.2018Oct12;46(18):9253-9263.3.KruppG.RNAsynthesis:strategiesfortheuseofbacteriophageRNApolymerases.Gene.1988Dec10;72(1-2):75-89.4.CheethamGM,JeruzalmiD,SteitzTA.StructuralbasisforinitiationoftranscriptionfromanRNApolymerase-promotercomplex.Nature.1999May6;399(6731):80-3.5.BIASeparations-Purificationofsingle-strandedmRNA:Thetoolboxforthenextgeneration编辑于2021-12-2018:54新冠疫苗mRNA新冠疫苗的优点mRNA​赞同​​1条评论​分享​喜欢​收藏​申请转载​文章被以下专栏收录mRNAFactoryKissRNA 分享mRNA技术前沿进展