[求救] pcDNA3.1(+)stable clone建立- 看板Biotech - 批踢踢實業坊

各位版友大大們好最近小弟的實驗要開始建立以pcDNA3.1(+)為載體的Stable clone MCF7細胞株建立的方式參考學長姐的實驗記錄以及pcDNA3.1(+)的產品資訊 ... 批踢踢實業坊 › 看板Biotech 關於我們 聯絡資訊 返回看板 作者shinchenboy(欣承男孩)看板Biotech標題[求救]pcDNA3.1(+)stableclone建立時間ThuJun1113:32:362015 各位版友大大們好 最近小弟的實驗要開始建立以pcDNA3.1(+)為載體的StablecloneMCF7細胞株 建立的方式參考學長姐的實驗記錄以及pcDNA3.1(+)的產品資訊 主要的方法是先把pcDNA3.1(+)transfect到MCF7細胞之後 隔24小時後有收一些細胞下來觀察transfection有無成功 然後剩下的細胞則是繼續培養在含有抗生素G418的medium中 來篩出stableclone出來每2天要換一次medium大約要篩2週 G418最後在細胞中的濃度是1ug/ml(此濃度是參考畢業學長姐的論文) 根據RNA定量的結果證實transfection是有成功的 但是剩下來培養在含G418的細胞卻發生以下的現象: 1.一開始剛加G418的時候好好的，隔天看細胞發現細胞有凋亡大約5成，再隔天看 發現細胞凋亡大約到7成了...(存活下來的細胞只剩3成) 2.後來我換了一次medium，重新加入G418，隔天再看一次細胞，發現已經凋亡了約9成 ，再隔天看一次細胞，發現存活下來的細胞屈指可數...... 想要問版友大大們這樣的現象是正常的嗎? 我的理解是加入G418最主要的目的是為了要殺掉沒有被成功transfect的細胞 讓有成功transfect的細胞存活下來 但是今天我的細胞再加入G418後幾乎都死光光了 可是從RNA定量的結果來看我pcDNA3.1(+)應該是有成功送入MCF7才對 所以會不會是以下兩個問題 1.G418加入的濃度過高:加入的濃度條件是我參考學長姊的畢業論文，他們用的plasmid 和細胞都和我一模一樣，所以我想說這個濃度應該是很適當的才對 2.選用的抗生素不恰當:pcDNA3.1(+)vector內包含抗Neomycin的基因，G418是Neomycin 的衍生物，所以我想說應該也不是這個原因才對 拜託了各位大大們小弟會感激不盡 小弟我好想要趕快畢業阿QQ -- ※發信站:批踢踢實業坊(ptt.cc),來自:140.112.121.119 ※文章網址:https://www.ptt.cc/bbs/Biotech/M.1434000758.A.862.html →a90648:stableclone是指你送進去的plasmid有插進genome中06/1113:58 →a90648:數量本來就不會太多了，不會你的細胞我沒使用過所以不知道06/1113:59 →a90648:一般狀況下成功率有多少06/1113:59 →a90648:而且你一開始送進去後抽RNA轉RT去看結果基本不准06/1114:00 →a90648:即使有處理DNaseI還是有很高機會去P到plasmid06/1114:01 →a90648:要確認的話我們實驗室一般是用western或是co-transfect06/1114:04 →a90648:GFPplasmid06/1114:04 →a90648:細胞有亮基本上就表示有transfect成功，但是要變stable06/1114:05 →a90648:還是會因為細胞不同成功率會差很多06/1114:06 推FYT0429:G418的使用濃度你可以先用96孔盤來測試，06/1114:48 →FYT0429:找到lethalconcentration再往下調100~200ng/ml06/1114:49 →FYT0429:有時候這些東西在不同人手上就是不一樣，玄玄der06/1114:49 推MDCCLXXVI:用G418ok06/1118:50 →blence:你把transfection成功當做是stablecandidate了,其實差異06/1119:22 →blence:很大,如果G418加了不會死,那當初就不需特別用G418篩了阿06/1119:24 →blence:你這裡的G418不只是殺"沒有被transfect"的細胞,而是要殺06/1119:29 →blence:non-integrated"的細胞,所以才會被稱為stableclone06/1119:31 推wanderchang:私以為stableclone至少是一個月的事？需要讓時間06/1120:30 →wanderchang:把transient，not-so-stable跟stableclone區分開06/1120:30 →wanderchang:來06/1120:30 →Ice9:你的問題2很嚴重啊。

我覺得有些東西你不弄清楚，還是緩點畢06/1208:51 →Ice9:業的好。

ps.一個是phosphotransferase一個是antibiotic06/1208:55 →Ice9:嘖！抱歉，我眼殘了。

自打臉～～06/1208:57 →Ice9:我個人是覺得你transfection可能並没有你想像來得高。

一是用06/1209:02 →Ice9:a90648網友說了的，你測試的手段太單一，而且可信度可能不大06/1209:03 →Ice9:二是你的control組的死亡率如何？我猜也和你的實驗組一樣的06/1209:04 →Ice9:速度。

這樣可能問題並不在selection本身，而是細胞有問題。

06/1209:05 →Ice9:而且，用1ug/ml來篩選，壓力太小了，如果tranfect成功，不06/1209:06 →Ice9:太可能一開死就死一大票。

1ug/ml比較像是maintain時的濃度。

06/1209:07 →blence:我猜是寫錯了,應該是1mg/ml,就算maintain也至少要50ug/ml06/1210:18 →blence:我們MCF7用的是300-500ug/ml這個範圍06/1210:19 推MDCCLXXVI:質體的品質ok嗎？濃度有跑膠確定嗎？有時機器測不準06/1212:21 推chaunen:推樓上~若質體supercoil的比例低,transfect的比例會大降06/1301:38 →chaunen:若表現的是原先MCF7沒有的基因,跑QPCR會很明顯06/1301:39 推chaunen:即使只有少數的細胞有表現06/1301:43 推chaunen:可以1.testtransfectioncondition(拿個表現GFP的質體)06/1301:48 →chaunen:2.同M大檢查質體quality(100ng跑個1%agarosegel)06/1301:52 →chaunen:3.正在select的MCF7如果還沒死光,就繼續篩(大概2-4周)06/1301:55 →blence:其實沒必要探討supercoil與testcondition,stable不講求這06/1310:48 →blence:些,而是integration,所以才有linearizedplasmidfor06/1310:50 →blence:stabletransfection的嘗試;transfect再好細胞也是死一堆06/1310:55 推chaunen:transfection效率高integration也會比較高吧?06/1400:17 推chaunen:跑膠看supercoil的比例只是要驗證這管plasmid的品質,06/1401:02 →chaunen:排除gDNA,RNA汙染外,一般來說supercoil比例應該最高06/1401:03 →chaunen:比例低則可能已經產生nickedform並不適合transfection06/1401:03 →chaunen:B大提到的linearizedplasmid是會增加integration沒錯06/1401:04 →chaunen:但前提是plasmidDNA品質好的條件下.06/1401:04 推chaunen:除了plasmid品質外,我想transfectioncondition也蠻重要06/1401:21 →chaunen:照原PO的結果來看,推測transfection效率可能不佳,06/1401:21 →chaunen:導致細胞一下子就死光,幾乎沒有細胞撐過transientstage06/1401:22 →chaunen:更別說integrate到gemone的比例又更少了...06/1401:22 →chaunen:不過我有點好奇,原PO該不會加到puromycin了吧...06/1401:24 →chaunen:以上只是個人看法,有錯還請指教(抖~)06/1401:24 推tynse71864:是說送進去的是單純的vector嗎還是有其他的表現pr06/1412:07 推tynse71864:protein06/1412:09 →tynse71864:我之前做tf(用puro）最後大概剩一成吧還是能挑06/1412:10 →shinchenboy:我確定我是加G418然後篩選濃度我打錯了是1000ug/ml06/1510:22 →shinchenboy:然後我送入空的vector或是有insert外來序列的vector06/1510:24 →shinchenboy:一樣在加入G418之後幾乎是死光的狀態我覺得有可能是06/1510:26 →shinchenboy:我transfection的過程就沒有成功plasmid的品質我會06/1510:28 →shinchenboy:跑膠去測試謝謝各位大大們的建議小弟感激萬分06/1510:29 →Ice9:呃，你應該也要有個没transfect的純細胞當對照吧？06/1521:43 推tynse71864:有篇Lonzastableclone的protocol可以參考~06/1720:55 推ararthur:1mg/ul可能太強了還是先titrate濃度再看看吧而且有些07/2316:01 →ararthur:時候是transfect完後先多養兩天再開始Selection讓他有07/2316:02 →ararthur:點時間表現resistantgene否則即使有transfect進去也會07/2316:02 →ararthur:被你掛掉至於integrated與否應該是selection後期的事07/2316:03