全基因體定序Whole Genome Sequencing (WGS) - 圖爾思公司

全基因體定序是針對特定模式物種的完整基因體定序。

目前已完成全基因體定序的物種包括人類以及數種模式動物。

許多影響人類健康和生活的物種，比如細菌和真菌也有許多全 ... 全基因體定序WholeGenomeSequencing(WGS) 首頁技術服務次世代定序服務(NGS)基因體定序全基因體定序WholeGenomeSequencing(WGS) 技術服務 次世代定序服務(NGS) 微生物基因體定序 基因體定序 RNA定序 第三代定序服務(PacBio/ONT) OxfordNanoporeTechnologies PacBio 10xGenomics 生物技術服務中心 胜肽合成服務(Peptidessynthesis) 蛋白表達服務(ProteinExpressionService) 客製化抗體服務(CustomizedAntibodyService) 酵素免疫分析法服務(ELISAservice) 組織包埋切片免疫組織染色服務(IHC) 端粒長度偵測服務(Telomerelengthmeasurementservice) RNAi/miRNAMimics&Inhibitors合成服務 基因與轉錄組檢測服務(GeneandmRNAdetectionservice) 探針合成服務(ProbeSynthesis) CRISPR/Cas9基因編輯材料 基因合成服務(Genesynthesis) 樣品製備服務(Samplepreparation) 小分子定量檢測(SmallMoleculeQuantification) 蛋白質體服務(Proteomics) 二維電泳(2DGel) 蛋白質定性分析 蛋白質轉譯後修飾作用分析(PTM) 蛋白質定量分析 蛋白質結合分析 生物資訊分析(Bioinformatics) 代謝體服務 非標靶代謝質體學分析 標靶代謝質體學分析 代謝體生物資訊分析 委託研究服務(CROservice) 重組蛋白表達服務(RecombinantProteinProductionService) 抗體生產、製備、開發技術服務(AntibodyProduction&DevelopmentService) 生物藥物研發服務(BiopharmaceuticalDevelopmentService) 全基因體定序WholeGenomeSequencing(WGS) 樣品需求 全基因體定序是針對特定模式物種的完整基因體定序。

目前已完成全基因體定序的物種包括人類以及數種模式動物。

許多影響人類健康和生活的物種，比如細菌和真菌也有許多全基因體定序的案例。

此項研究適用於特定物種基因體的深度分析，例如人類疾病相關的基因研究。

立即填寫訂購表單 服務流程 分析流程   樣品需求 DNA總量: 一般樣品:≧1.0ug 石蠟包埋樣品(FFPEsample):≧1.6ug DNA濃度:≧50ng/ul(Qubit®測定) 樣品體積:≧20ul ※樣品濃度定量Qubit®測定為主 樣品純度： OD260/OD280=1.8-2.0 DNA無降解且無汙染 建議先行以電泳膠圖確認片段大小及DNA完整度，並於送件時提供膠圖結果 (A)DNAMarker,(B)合格樣品(C)降解樣品 (D)RNA汙染樣品(E)蛋白質殘留汙染樣品(以紅框標記汙染處)                     定序規格 Novaseq6000,paired-end150bp 常見問題 Q1.人類全基因體定序(WGS)應用在哪些方面？ A:1.在疾病研究方面：全基因體範圍內搜尋疾病相關候選位點或區域，特別適合於有較少分子研究基礎疾病類型或研究結構變異的情況。

2.人類演化、比較基因體學等的研究：可利用全基因體的基因資訊全面進行種族演化、種族特異性基因及區域的篩選。

  Q2.人類全基因體定序(WGS)的優勢為何? A:與外顯子定序與RNA定序技術相比，技術流程較為單純而成熟、易操作、易實現；與外顯子定序捕獲技術相比，可全面挖掘各種遺傳變異，特別是一些大的結構變異(倒置、易位、拷貝數變異)以及一些高GC含量的區域(也就是較難被WES定序到的區域)，在全基因體範圍內尋找與疾病或功能相關的位點；與傳統晶片分型技術(例如SNParray)相比，可發掘全新的(novel)和罕見(rare)的變異。

  Q3.全基因體定序(WGS)一般建議多少的定序深度? A:定序深度需要根據研究目的及預算來制定，一般建議至少達到平均30x的定序深度，30x已經能夠檢測出大部份的變異位點(遺傳變異)，但是在如果希望檢測出更多或是更大規模的結構變異，或是腫瘤組織攜帶的變異，建議可以採用50-60x左右的定序深度。

  Q4.全基因體定序(WGS)是否可以定序到粒線體DNA(mtDNA)的序列呢? A:雖然WGS或是WES的定序數據中，能夠涵蓋到一小部分的粒線體序列，但是常規分析會過濾掉大多數的mtDNA位點，分析結果的可信度也較低，除了使用專為mtDNA設計的比對流程之外，也建議可以嘗試透過捕獲mtDNA建庫定序的方式來取得更為可信的結果。

  Q5.INDEL或SNV的vcf檔，各樣品genotype的欄位要如何閱讀? A:vcf(variantcallformat)檔為記載變異資訊的檔案，每個樣品提供的註釋資訊順序，是根據欄位FORMAT提供的資訊排列，該欄位縮寫名稱的意思，可參考以下vcf檔案的說明文件(https://samtools.github.io/hts-specs/VCFv4.2.pdf)。

  Q6.全基因體定序(WGS)與全外顯子定序(WES)分析上的差異? A:WGS和WES主要差別在於涵蓋人類基因體的區域大小不同。

目前在分析singlenucleotidevariation(SNV)、insertionanddeletion(Indel)和拷貝數變異(copynumbervariation,CNV)上，資料來源是WGS或是WES用的分析工具大致上是相同的，都是使用GATK(genomicanalysistoolkit)的分析流程。

不過在分析大片段的變異，例如:結構變異(structuralvariation,SV)，建議使用WGS的定序數據來分析。

因為WGS的優勢在於對於基因體覆蓋度高並且具有較好的一致性，分析出來的結果當然比較全面並且可信度較高。

不過，有時也會針對不同研究目的而使用不同的分析方法。

WGS與WES的差異詳見次世代定序知識櫥窗（http://toolsbiotech.blog.fc2.com/blog-entry-122.html）。

  Q7.文獻提到調高coverage有助於低頻率變異點的發現，以allelefrequency評估並找尋變異位點的策略，僅針對低頻率變異位點來說，有存在變異的位點，需要有多少數量的reads來支持(不包含normal位點)才會比較可信? A:在這邊低頻率變異點指的是在腫瘤組織內出現的變異點，假設其頻率為10%，表示平均而言要有100條reads才會有10條是有變異點的reads，所以必須要先了解該次定序的深度為多少，才比較有依據來認定何謂可信的變異點。

  Q8.人類參考基因體版本GRCh38和版本hg19相比之下，在基因的座標上有差異嗎?如果有，可以做轉換跟對應嗎? A:GRCh38與hg19在基因座標上是完全不一樣的，可以使用liftover(https://genome.ucsc.edu/cgi-bin/hgLiftOver)工具作轉換。

版本差異可參考次世代定序知識櫥窗(http://toolsbiotech.blog.fc2.com/blog-entry-119.html)   Q9.計算腫瘤突變負荷量(tumormutationalburden,TMB)，在WGS/WES不同定序深度間該如何校正? A:計算TMB時，的確會有很多因素影響，例如定序深度、變異篩選的條件、還有樣品內腫瘤細胞和正常細胞的比例…等因素都會直接影響到計算TMB的數值，目前似乎還沒有公認比較好的校正方式，也許在未來研究人員收集更多資訊之後會有比較好的解決方式，可參考Fancello,L.,Gandini,S.etal.Tumormutationalburdenquantificationfromtargetedgenepanels:majoradvancementsandchallenges.j.immunotherapycancer7,183(2019)，這篇論文中有詳細的討論。

  Q10.請問目前有許多不同的分析變異方法，可以互相比較嗎?或是該如何選擇? A:現在分析方法相當的多，也有很多文獻是進行分析方法的比較，比較內容大致有sensitivity(敏感度),Specificity(特異度),Falsepositiverate(偽陽性率),Positivepredictivevalue(陽性預測值),Falsediscoveryrate(錯誤發現率)等這幾項，各有其優缺點，我們所選擇的是目前最多人使用的分析變異方法，而有一些大型研究也會採用多種分析變異的方法之後採用部分聯集或是交集的方式，增加變異的正確率。

    Q11.目前有哪些資料庫可以用在變異註解(annotation)? A:變異註解對於研究人員相當地重要，可用在理解變異的影響，以及利用註解進行篩選，簡略介紹如下，詳細項目請參閱圖爾思提供的範例報告。

依照註解內容可以分為五大部份： 第一部分：變異位置在基因體中的區域、變異種類等，使用RefSeq、Ensembl的資料庫。

第二部分：使用不同的人群資料庫，如dbSNP150、COSMIC、1000genomes、ExAC、gnomAD、ClinVar等進行比對，可了解該變異在人群中的發生頻率。

第三部份：使用多種功能預測軟體預測變異造成的可能影響，如Polyphen、SIFT等。

第四部份：變異資訊，如：定序深度、基因型及變異比例等，此部分來源是分析時所得到的結果。

第五部份：與基因功能資料庫(GeneOntology)、人類疾病資料庫(OMIM)、人類罕見疾病資料庫(Orpha)、生物功能途徑資料庫(KEGG,PID,BIOCARTA,REACTOME)進行比對。

  Q12.在研究癌症體細胞變異時，如果沒有正常細胞當作配對的樣品，只有癌組織的DNA，可否分析出體細胞變異呢? A:一般在分析體細胞變異時，最好要有同一患者的正常細胞DNA當作配對的樣品，因為這樣才能刪去遺傳性變異的部分，得到的才是屬於體細胞變異。

但是如果研究上真的無法得到這樣的配對樣品，目前GATK有開發tumor-only的分析模式，利用演算法和大型人群資料庫當作篩選的方法，刪除的效果當然沒有利用配對樣品DNA來的好，所以分析出來的結果當中還是有部分是屬於遺傳性變異。

或是另一種方式就是提供一群健康者的(非配對)DNA進行定序，當作對照組以幫助篩選出體細胞變異。

  Q13.GATK版本的差異？是否要將過去的分析改用新版重新分析才有可比性? A:不同的版本分析出來的變異數目，以GATK3和GATK4進行比較，差異蠻大，所以建議如果是同一個研究，應該採取相同的版本分析，而且不僅是尋找變異的工具要版本一致外，資料前處理的分析流程應該也要採取相同的版本和參數設定。

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