CRISPR發展之英雄榜| CASE 報科學

D. 所形成結構(Cas9+tracrRNA+crRNA）開始尋找和間隔序列相吻合的序列，找到後Cas9會抓住具有分子把手功能的PAM，然後結合至目標區。

醫學&基因  2017年11月18日2019年04月12日 CASEPRESS CRISPR,CRISPR專題,基因編輯 德州大學分子生物科學研究所馬千惠編譯/臺大科教中心陳藹然責任編輯 編譯來源：Lander,E.S.(2016).TheHeroesofCRISPR. Cell164,18-28. 2013年一篇指出CRISPR(clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats)技術可以準確且有效率地編輯活體真核細胞基因體的研究報告，在科學界颳起一陣風暴，從生物醫學到農業，有成千個實驗室應用此技術。

本文將探討從二十年前起發現微生物的基因體含有奇怪的重複序列，經確認為此一適應性免疫系統，到了解其生物特性，進而運用在基因工程上的發展過程，以及這科學研究歷程給我們的啟示。

CRISPR規則性間隔重複迴文序列群的發現，起源於西班牙一地中海海港，FranciscoMojica的指導教授發現生活在沼澤中一耐鹽性極高的古細菌，其基因體會因為生長環境鹽度不一樣，而被限制酶切出不同片段。

Mojica分析這些不同的基因片段，發現一個特殊結構含有類似迴文的重複序列及間隔，和其他已知的微生物重複序列不同。

之後十年的時間，他致力於解開這結構的神密之處，發現其他的古細菌也具有相似的重複序列，而一日本研究團隊在細菌裏也發現類似的結構。

Mojica認為如此相去甚遠的微生物卻有相似的結構，在原㧡生物中一定有其特殊意義。

由於Mojica才剛開始教職工作，研究經費不足，只好轉而以生物資訊學來分析這奇特的重複序列，並命名為SESRs(shortregularlyspacedrepeats)，之後修改成CRISPR(clusteredregularlyinterspacedpalindromicrepeats)。

20世紀結束時，Mojica已在二十種微生物基因體內找到CRISPR序列。

其他研究團隊在不同微生物也有相同的發現，並且找到CRISPR相關基因（CRISPRassociatedgenes,cas)，但是其生物功能仍是未知，於是眾多假說被提出。

後來Mojica在分析重複序列之間的間隔序列（spacer)有了重大發現：一特定種大腸桿菌的CRISPR的間隔序列，居然和感染許多不同種大腸桿菌的P1噬菌體的基因序列吻合，可是此一特定種的大腸桿菌本身並不會被P1噬菌體感染，也就是説擁有此間隔序列，可以保護細菌本身不會再被同一噬菌體感染。

他又繼續分析了4,500段間隔序列，其中88段和已知序列吻合，其中三分之二是來自病毒或接合質體。

可是當他要發表此重大的發現時卻連續被各大期刊拒絕，經過十八個月的努力，終於在2005年發表於JournalofMolecularEvolution。

同時CRISPR系統的研究在世界各地陸續有不同的進展。

法國國防部的科學家GillesVergnaud分析造成越南1964-1966年鼠疫的61株樣品，發現其重複序列都相同，只有其同事ChristinePourcel發現在CRISPR的前端間隔序列(spacers)有所不同，因此提出CRISPR可能是將過去受感染的記憶保存下來，保護細菌不再受感染，但是他們的論文同樣面對被期刊拒絕的狀況，最後晚Mojica一個月的時間發表於Microbiology。

服務於法國一食品公司的研究者PhilippeHorvath和其同事RodolpheBarrangou在2007年以實驗證明CRISPR是一適應性防禦免疫機制，同時他們也發現Cas7參與形成新的間隔和重複序列，以及Cas9具有兩種核苷酸酶部位HNH和RuvC可以切斷核苷酸，且為達到完全的免疫功效，間隔序列和標的序列必須完全相同。

2008年德國科學家JohnvanderOost和其同事首先直接設計出以CRISPR為基礎的免疫機制，像是幫細菌打了疫苗，不再受噬菌體感染。

美國科學家LucianoMarraffini和ErikSontheimer則證實CRISPR是以DNA為標的，並首先提出CRISPR可能可以應用於不同物種的基因編輯，雖然有提出專利申請，但由於缺乏實驗佐證，後來終究放棄。

SylvainMonieau延續Barrangou先前對Cas9的研究，發現Cas9會準確地切在PAM（proto-spaceradjacentmotif)前三鹼基對的位置。

另外EmmanuelleCharpentier和JὂrgVogel團隊則發現在細胞內第三多的轉錄物tracrRNA（trans-activatingCRISPRRNA)會和由CRISPR序列所轉錄出來的crRNA前身結合，再由RNaseIII修剪為具功能性的產物，研究至此階段已經能掌握CRISPR系統所需的要件。

接下來是VirginijusSiksnys成功地將CRISPR系統移至不同的生物體，達到一重要里程碑，確認CRISPR-Cas9系統所需且足夠的元件：Cas9核苷酸䩈、crRNA以及tracrRNA。

他們以純化的Cas9蛋白研究整個過程的細節，最戲劇化的發現是利用設計CRISPR裏不同的間隔序列（spacer)，讓此系統去辨識特定的基因位置並切斷DNA，Siksnys在2012年以此申請美國專利。

大約在同時Charpentier和JenniferDoudna合作也有同樣的發現和進展，他們更進一步將crRNA和tracrRNA連結成sgRNA(single-guideRNA)，此一概念後來被廣泛使用，經修改可以更有效地在生物體內作用。

兩個團隊也同時都提出此一系統未來在生物科技上的應用潛力。

圖一發展基因體編輯技術的基礎中三種已知系統中最簡單的系統，Class2,TypeIICRISPR-Cas系統。

A.系統包含了CRISPR序列、四個蛋白基因(cas9,cas1,cas2和cns2)以及tracRNA。

其中CRISPR序列包括重複區域（黑色鑽形）與外來入侵的基因片段所形成的間隔序列（spacer,彩色矩形）。

一旦入侵的DNA和間隔序列吻合，cas9所轉譯出核苷酸酶，會將其切斷，達到免疫的功效。

而另外三個蛋白則是從入侵的DNA片段做出新的間隔序列，使自身不會再受相同的感染。

B.Pre-crRNA和tracrRNA被轉錄出來C.Pre-crRNA和tracrRNA以其互補序列結合在一起，再由Cas9蛋白及RNaseIII將其修短。

D.所形成結構(Cas9+tracrRNA+crRNA）開始尋找和間隔序列相吻合的序列，找到後Cas9會抓住具有分子把手功能的PAM，然後結合至目標區。

E.於PAM上游三鹼基對處切斷目標DNA 下一個重大的發展來自華裔科學家張鋒(Feng Zhang)，他進一步修改Cas9，找到適合存在人類細胞內的tracrRNA，成功地將CRISPR系統應用到哺乳動物細胞，可以高效率且準確地修改特定基因，張鋒更進一步以此系統做出複雜的老鼠系統來研究遺傳疾病及癌症，並且從全基因庫篩檢，研究特定生物過程的必需基因，同時他和生物資訊學者Kooin發現新的Class2CRISPR系統，只需另一核苷酸酶及crRNA兩個元素便足夠。

張鋒在2013年初於Science發表論文，成為此一領域被引用最多的文章。

另一科學家GeorgeChurch也和張鋒有相同的發現，即以全長的crRNA-tracRNA連結在一起，在哺乳動物細胞內的功能比較好，他同時編輯七處基因，分析不同的基因重組機制，並在同一期期刊發表編輯人類基因體的論文。

至此眾多科學家們陸續成功地以CRISPR為基礎去編輯許多不同生物的基因體，更朝人類基因療法及農業生產發展，甚至提出以此技術去設計人類胎兒的可行性。

圖二二十年來CRISPR系統的發展橫跨九個國家十二個城市1.1993年發現CRISPR2.2003年CRISPR是一適應性免疫系統3.2006年實驗證實CRISPR確實具適應性免疫功能4.2008年程式設計CRISPR5.2008年CRISPR作用在DNA6.2010年Cas9蛋白在crRNA的引導下切斷雙股DNA7.2010年發現tracrRNA8.2011年在相隔甚遠的生物體內重建CRISPR系統9.2012年在生物體外研究CRISPR10.2012年在哺乳類動物細胞内進行基因體編輯 二十年來整個CRISPR系統的發展過程，訴説著許多不同的層面的故事，包含了科學的研究發現、發表論文所面對的困難、研究經費問題和此技術可能引發的科學倫理問題，以及社會大眾的認知。

最初開研究動機只是想要了解耐鹽性微生物所含的奇怪重複序列、軍事上要抵抗生化武器或是食品工業上要增加優格的生產，並不是以編輯人類基因體或治療疾病為目的。

而目前新興的科學研究方法，是在沒有假設前提下，去分析大數據及基因庫的資料。

更特別的是，在CRISPR系統發展史上幾個關鍵發現的科學家都非常年輕，他們不懼風險願意挑戰，擁有強烈的研究動機與信心，卻常受限於沒有足夠的研究經費，這點暴露出科學研究經費資源分配問題，值得國家重新考量嚴肅面對。

  參考文獻 Lander,E.S.(2016).TheHeroesofCRISPR. Cell164,18-28. Mojica,F.J.,Juez,G.,andRodriguez-Valera,F.(1993).TranscriptionatdifferentsalinitiesofHaloferaxmediterraneisequencesadjacenttopartiallymodifiedPstIsites.Molecularmicrobiology 9,613-621. Mojica,F.J.M.,Diez-Villasenor,C.,Garcia-Martinez,J.,andSoria,E.(2005).Interveningsequencesofregularlyspacedprokaryoticrepeatsderivefromforeigngeneticelements.JMolEvol 60,174-182. Cong,L.,Ran,F.A.,Cox,D.,Lin,S.,Barretto,R.,Habib,N.,Hsu,P.D.,Wu,X.,Jiang,W.,Marraffini,L.A.,etal. (2013).MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.Science 339,819-823. Mali,P.,Yang,L.,Esvelt,K.M.,Aach,J.,Guell,M.,DiCarlo,J.E.,Norville,J.E.,andChurch,G.M.(2013).RNA-guidedhumangenomeengineeringviaCas9.Science 339,823-826. (Visited1times,1visitstoday) views ←CRISPR會不會是可以修正遺傳疾病基因變異的立可白呢？ 殺害蟲也殺「蜂」景？-新菸鹼類農藥的環境風險→ 找不到文章？ 好書推薦 《心靈黑洞：意識的奧祕》 《物理奇才奇事》 諾貝爾物理獎得主楊振寧推薦 《破解動物忍術》