基因編輯的新世代來臨－ CRISPR 技術起源與簡介

... 內的CRISPR array 會轉錄出pre-crRNA，並和tracrRNA (trans-activating ... break) 作用，造成這些外來DNA 失去功能，達到快速辨識的防禦效果。

跳到主要內容 基因編輯的新世代來臨－CRISPR技術起源與簡介 張貼者： welgene 日期： 11月11,2016 取得連結 Facebook Twitter Pinterest 以電子郵件傳送 其他應用程式 我們都知道人類及各種動物在有病毒及病菌感染的情況下，會啟動自身白血球的免疫系統來抵禦外來物，由抗原呈現細胞APC(antigen-presentingcells)、T細胞和B細胞的合作分工之下，能辨識並對相同的外來物啟動更快速有效的防禦機制(Fig1)，這種記憶分工的免疫效應過去曾以為只存在於真核多細胞生物。

不過在原核生物中，其實也擁有它們自己的記憶性免疫系統，其中一種就是近幾年發展火熱的分子生物技術CRISPR(Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromicrepeats)的起源。

Figure1.真核生物的後天免疫系統 說到CRISPR的發現最早可追溯到1987–1993年間，由大阪大學(OsakaUniversity)的石野良純(YoshizumiIshino)1及西班牙UniversityofAlicante的FrancisMojica2都分別發現此特殊的序列組成持並給予CRISPR的命名，也是發現原核生物CRISPR這種後天記憶性免疫系統的開始，往後的幾年，陸續發現與其系統相關的CRISPRarray片段、Cas9(Casfamily)酵素、PAM(protospaceradjacentmotif)區域3以及guideRNA4等。

CRISPR是古生菌及細菌中的一種後天免疫機制，當細菌被病毒感染後，病毒的雙股DNA會進入到細胞中，此時細胞內的CAS蛋白會去辨識這些外來DNA並進一步將其切為小片段並儲存於基因組的序列中，這些由外來序列的spacer和固定的directrepeats交互組成的區域稱為CRISPRarray，當相同的病毒第二次感染時，細胞內的CRISPRarray會轉錄出pre-crRNA，並和tracrRNA(trans-activatingRNA)結合變成guideRNA，此時細菌的Cas9蛋白就可以帶著guideRNA去辨識這些外來的序列是否和這些CRISPRarray帶有相同的互補片段，若是相同的互補序列即可進行結合並由Cas9蛋白對這些外來雙股DNA進行切斷的DSB(doublestrandbreak)作用，造成這些外來DNA失去功能，達到快速辨識的防禦效果。

Figure2.CRISPR機制圖解 近幾年對細菌中CRISPR運作機制的逐步了解，從2012年開始陸續將此系統研究用在分子生物技術中，透過CRISPR辨識序列原則來設計出人工的crRNA與Cas9，運用於非細菌的CRISPR/Cas9實驗，由於Cas9的DSB作用會啟動細胞體內的DNA修復機制如NHEJ或者HDR，因此能藉由不同的需求來將目標片段進行indels作用或者序列插入及互換等5(Fig3)。

Figure3.產生DSB後的DNA修復機制5。

在2013年，麻省理工學院的張峰博士(FengZhang)6更將CRISPR/Cas9技術運用至人類細胞與老鼠細胞的genome編輯，設計出guideRNA包含前端約20nt的辨識區域來成功達到基因編輯的效果，更加簡化實驗的技術與門檻，如今，各種CRISPR/Cas9實驗研究陸續被開發出來，透過不同物種的CRISPRrepeat序列或者不同的Cas9突變型5,7(Fig4,5)，經由細胞轉染及病毒感染等方式將CRISPR/Cas9系統送入活體細胞中，達到多元化的DNA編輯及應用，正式開啟了基因編輯的新紀元8(Fig6)。

Figure4.Cas9的變化型及其應用5。

Figure5.CRISPR/Cas9的實際DNA編輯應用7。

Figure6.統計至2016年初，近幾年CRISPR相關研究於Pubmed有爆發性的成長8。

參考文獻:1.IshinoY,ShinagawaH,MakinoK,AmemuraM,NakataA(December1987).Nucleotidesequenceoftheiapgene,responsibleforalkalinephosphataseisozymeconversioninEscherichiacoli,andidentificationofthegeneproduct.JournalofBacteriology.169(12):5429–33.2.MojicaFJ,FerrerC,JuezG,Rodríguez-ValeraF(July1995).LongstretchesofshorttandemrepeatsarepresentinthelargestrepliconsoftheArchaeaHaloferaxmediterraneiandHaloferaxvolcaniiandcouldbeinvolvedinrepliconpartitioning.MolecularMicrobiology.17(1):85–93.3.Bolotin,A.,Quinquis,B.,Sorokin,A.,andEhrlich,S.D.(2005).Clusteredregularlyinterspacedshortpalindromerepeats(CRISPRs)havespacersofextrachromosomalorigin.Microbiology151,2551–2561.4.Brouns,S.J.,Jore,M.M.,Lundgren,M.,Westra,E.R.,Slijkhuis,R.J.,Snijders,A.P.,Dickman,M.J.,Makarova,K.S.,Koonin,E.V.,vanderOost,J.(2008)SmallCRISPRRNAsguideantiviraldefenseinprokaryotes.Science321,960-964.5.JeffryDSander&JKeithJoung.CRISPR-Cassystemsforediting,regulatingandtargetinggenomes.NatureBiotechnology32,347–355(2014)doi:10.1038/nbt.2842.6.CongL,RanFA,CoxD,LinS,BarrettoR,HabibN,HsuPD,WuX,JiangW,MarraffiniLA,ZhangF.Science.MultiplexgenomeengineeringusingCRISPR/Cassystems.2013Feb15;339(6121):819-23.doi:10.1126/science.1231143.Epub2013Jan3.7.FranciscoJ.Sánchez-Rivera&TylerJacks.ApplicationsoftheCRISPR–Cas9systemincancerbiology.NatureReviewsCancer15,387–395(2015)doi:10.1038/nrc3950.8.Biosynthesis,ChemicallyModifiedNucleicAcidsforCRISPR-Cas.http://www.biosyn.com/tew/Chemically-Modified-Nucleic-Acids-for-CRISPR-Cas.aspx 生技小知識 取得連結 Facebook Twitter Pinterest 以電子郵件傳送 其他應用程式 留言 搜尋此網誌 熱門文章 二級抗體選擇指南-二抗選得好實驗難不倒! 二級抗體能結合至一級抗體，常用於檢測和純化目標蛋白的分析中，如ELISA、免疫螢光法(IF,Immunofluorescence)、西方墨點法(WB,WesternBlot)。

二級抗體還可與其它像是螢光染劑或酵素等的小分子結合，使得它們更容易被檢測。

使用二次抗體能減少一級抗體額外嵌合分子標記的需求，使得一級抗體能更有效地辨識目標抗原。

此外，一級抗體能與嵌合不同分子標記的同種二級抗體作結合，讓檢測更為彈性與強大。

EpiGentek的高品質二級抗體適用各種實驗應用，此外也有多樣的分子標定嵌合種類與抗體類型可供選擇，但在眾多的二級抗體中如何選擇最適合的呢?只要把握以下要點就不用擔心：1.宿主：宿主是製造抗體的來源物種。

二級抗體的生產來源必定是不同於一級抗體的物種來源，由此來增加二級抗體對於一級抗體的辨識特異性。

例如一級抗體來自於小鼠(mouse)時，二級抗體就必須是抗小鼠(anti-mouse)的，或者是原本不會在小鼠中出現的抗體。

2.檢測方法：選擇最佳二級抗體另一個重要因素是分析方法。

如果目標分析方法是WB、IP或者ELISA，理想的二級抗體是與酵素嵌合的。

如果是IF或流式細胞儀(FC,FlowCytometry)的實驗，嵌合螢光染劑的二級抗體則是最好的選擇。

若是要偵測低表現量的蛋白質，推薦可以選擇嵌合生物素(biotinylated)的二級抗體。

3.純化方式：抗體的純化經由將其通過具有固定化配體樹脂(immobilizedligandresin)的管柱。

配體和抗體相互結合後，血清經由清洗步驟並加入試劑來分離配體與抗體的結合作用，進而產生純化的抗體。

這類型的純化是以目標抗原(抗體辨識配體)或親和性配體(配體辨識抗體)的方式進行。

目標抗原方式只適合用於純化特定抗原專一性的二級抗體，一般最常用純化二級抗體的方式則是親和性配體方法。

親和性純化的抗體可以增加其專一性、降低背景值並提高敏感性。

經過純化的抗體能有效減少其差異性，使其獲得更佳的實驗重複性。

4.交叉吸附(Cross-adsorption)：交叉吸附步驟是一種提高二級抗體專一性的方式，將二級抗體經過含不同物種抗體的固定式基質管住，讓這些二級抗體辨識這些外來抗體，並經過辨識結合、沖洗等步驟，這個過程可 昨日的棄土明日的寶山-認識胞外體Exosome開啟研究新領域 胞外體(外泌體,exosome)是存在於真核生物中，用於包覆物質並釋放至細胞外的特殊小囊泡。

這些小囊泡平均大小落在30-100nm之間，在不同狀態、不同微環境產生的外泌體亦有不同的組成。

我們可以把這些細胞釋放出來的小囊泡，想像成生物體當中的快遞收送人員，蒐集許多的貨物並運送(擴散)至指定的鄰近細胞或其他位置，進而來控制生物表現。

其實在生物體中，細胞間的溝通有許多種方式，例如透過內分泌系統的激素來調節生長發育、或是透過免疫反應輸送抗體來防禦抵抗外來病原，但本次所分享的外泌體更為直接，能夠藉由包裹的蛋白質、microRNA、mRNA等來有效率地控制細胞基因表現和蛋白質功能的表達。

最早在1980年，就有醫學研究發現在癌症病人身上有特殊的包裹囊泡，將專屬癌症組織的抗體(antibody)由媽媽傳遞給新生兒而造成細胞表現異常1，然而對比其他胎盤組織的細胞卻沒有直接產生變異。

有了這個前例，醫學研究開始發現有許多過去認定細胞變異造成的異常，其實是由於這個小型的細胞快遞員進行細胞溝通所造成，而不是細胞原生的惡化或突變。

舉例來說，在1996年，Raposo等人的研究中發現，過去認為只會在免疫B細胞上形成的majorhistocompatibilitycomplex(MHC)II複合體，透過顯微攝影發現複合體同樣能被包裹在exosome中，外吐到鄰近的上皮細胞，並且再度融合在一般上皮細胞上，使之短暫地扮演誘導T細胞活化的功能2。

於下圖顯微鏡觀察可以清楚看見，黑色顆粒代表以奈米粒子標定MHCII的成像，緊貼於exosome表面攜帶(粒徑尺寸約為60-80nm，遠比Bcell小) .可以觀察到同樣標定MHCII，黑點皆座落在體細胞膜並累積，有明顯轉移的現象。

有了免疫學和癌症學的研究開啟新局，exosome引起科學界廣泛的重視。

後續研究中，Simpson等人統整exosome能夠攜帶的特殊蛋白質，有些能夠一次性包裹多種蛋白至不同細胞來影響整體的細胞功能，特殊的多型性對於接受exosome的細胞來說，甚至比激素或細胞自身的調控影響還巨大3。

在2003年的發表文獻中，第一次提供證據顯示exosome能夠包裹完整的HIV膜蛋白和表面抗原，形成 [試劑耗材]基本分生技術介紹PCRCloning-分生實驗的必經之路  你可能有聽過複製羊,複製豬,複製人,甚至克隆人這些名詞,其實都源自於clone這一詞,在生物學來說,clone指細胞從親細胞(parentcell)複製出完全相同的細胞,是一種無性的複製,有著相同的基因。

而這邊說的cloning,其實是一種技術,在分子生物學中,cloning是一種將DNA複製並殖入另一個細胞的技術,cloning也有人翻譯為轉殖或選殖。