蛋白質体學概觀 - 輔仁大學生命科學系

隨著基因體資料大增、電腦分析處理能力的進步及生物資訊學的發展，蛋白質體學研究才 ... 由此更可知蛋白質體學在新的疾病指標或疾病模式的發現上，所扮演的重要角色。

蛋白質体學概觀 整理：周旻恩   一、摘要   二、緒言   三、蛋白質體（Proteome）與蛋白質體學（Proteomics）   四、研究流程     1. 蛋白質檢體製備（Sample preparation）     2. 二維電泳分析（Two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE）        2.1 第一維：等電點聚焦電泳（Isoelectic focusing,IEF）        2.2    第二維：SDS-PAGE（Sodium DodecylSulfatePolyacrylamidegelelectrophoresis）    3. 電泳膠片染色及影像掃描（Computer scanning）    4. 影像分析（Image analysis）    5. 蛋白質點切割（Spots excision）    6. 蛋白質鑑定（Protein identification）        6-1 質譜儀分析（Mass spectrometry）        6-2   資料庫比對（Database Comparison-bioinformatics）   五、蛋白質體學之應用    1.    診斷標記（Diagnostic markers）及腫瘤標記（Tumor markers）       1-1感染性疾病       1-2   體液性疾病       1-3   心血管疾病       1-4   癌症醫學研究方面            1-4-1 乳癌 (breastcancer)            1-4-2 肺癌 (lungcancer)            1-4-3 結腸癌 (coloncancer)           1-4-4 腎臟癌 (kidneycancer)           1-4-5 轉移的潛力與癌症的治療 (metastaticpotentialandcancertreatment)      1-5 免疫性蛋白質 (immunogenicprotein)      1-6 體液中的醣蛋白    2        生化毒理及藥理學研究方面       2-1 磷酸化作用 (phosphorylation)       2-2  藥物代謝物和運送 (drugadductandvehicles)      2-3 荷爾蒙 (hormones)    3        在農業生物技術方面    4-1 追蹤複雜 (trackingcomplexity)    4-2  提昇農業產品 (improvedagriculturalproducts)   4-3  增加農產品價值 (valueaddedagriculturalproducts)   六、結論   七、參考資料       一、摘要     從各種原核生物至真核生物，如微生物、老鼠、人類，染色體序列陸續被解開來後，將成為龐大的基因資料庫，藉此相互比對以說明蛋白質所表現之圖樣，進而推論其蛋白質功能。

蛋白質體技術是倚賴質譜儀(mass spectrometry)及二維膠電泳(two-dimentional gelelectrophoresis)，以提供主要視窗來進入不同蛋白表現情形的分析(8)。

      所謂蛋白質體學，就是對於蛋白質進行大量分析，以提供後基因時代對基因功能多一些了解。

蛋白質體學可以分成三個主要領域：第一、對於蛋白質大量鑑定與轉譯後修飾進行微量蛋白質特性分析；第二、應用於比對疾病發展過程中不同蛋白質表現之情況；第三、運用mass spectrometry與yeast two-hybrid系統加以研究蛋白質間之作用關係(1)。

      從蛋白質的相同性與三度空間結構來預測細胞構造蛋白質之成份及其功能，是有其困難性，若是能從蛋白質體方向進行研究，或許能夠得到最終的答案；經由分子生物技術不斷的改革後，相信在未來幾年，蛋白質體學將會加速對蛋白質的生化功能、形成途徑與代謝過程之研究而更加了解(1)。

  二、緒言     基因體計畫 (genomeproject) 的各項研究已在世界各地陸續展開，目前完成的有酵母 (yeast)、大腸桿菌 (E.coli) 等，尚在進行中的有老鼠(mouse)、果蠅(drosophila)、植物 (arabidopsis) 以及人類基因體計畫(humangenome project)等。

這些基因結構研究完成，並非代表工作的完成，而是一條全新道路的開展，由於這些基因所表現之功能，才是科學家所要得知的。

而基因表現之執行者就是蛋白質，因此對整體蛋白質之研究乃二十一世紀生化學上最主要之課題(3)。

  美國於六十年代「登月計劃」後，由美國能源部及國家衛生研究院主導，展開長達十五年（1990年-2005年）的跨世紀人類基因體計劃（Human GenomeProject），試圖解開生命的奧秘。

在許多先進國家及醫藥、生物科技公司相繼加入，注了龐大的財力與人力，人類基因體草圖，已於目前完成解讀。

然而，基因體結構的完成並非代表對人類生命體已經有完整的解答；正如賽雷拉公司（Celera Genomics）總裁Dr. CraigVenter所說：「繪出人類基因體圖譜，只是代表生命科學的起點而已。

」依分子生物學的中心法則（Central dogma：DNA→RNA→Protein）得知，生命的分子，不論其遺傳物質為DNA或RNA，其最終產物均為蛋白質，由此可知，基因體功能的最終目的就是表現蛋白質；基因表現及調控（Gene expressionandregulation）的過程，則是為了保障蛋白質能適時、適地並適量的表現。

當基因體的研究正如火如荼的展開時，科學家赫然發現，身為萬物之靈的人類基因不過約三萬多個，與黑猩猩更有99 %的相同，而僅僅1 %基因的不同，卻造就人類與黑猩猩之間如此大的差異，當黑猩猩還在地上爬的時候，人類的足跡早已踏上月球(13)。

      基因表現的差異，並不一定代表其相對蛋白質或相關蛋白質群的功能或表現有所改變，而主要的原因在於上、下游蛋白質相互調節，或蛋白質與基因間彼此的調控。

因此，了解蛋白質表現圖譜（Expression profile）的變化趨勢，有助於疾病成因的探討、藥理藥化的研究、癌症醫學的應用、檢驗標記的開發等等。

在1995年出現了一個新名詞，蛋白質體（Proteome）-基因體上蛋白質表現的統稱，凡是經由蛋白質及轉譯後調節（Post-translational modification）的研究來探討基因表現的方法皆可稱之為蛋白質體分析（Proteomic analysis）；由於蛋白質體學的功能強大，因此在短短的幾年間即大量應用於基礎醫學研究。

在後基因體時代（Post-genomic era），蛋白質體學（Proteomics）具有高產能（High-throughout）、完整性（Global view），又能確認基因產物－蛋白質的表現差異，並進行fmole（10-15 莫耳）之超微量蛋白質鑑定及胺基酸序列分析，已受到大家所重視(4)。

  三、蛋白質體（Proteome）與蛋白質體學（Proteomics）    ”Theanalysisoftheentire PROTEincomplementexpressionbyagenOME.” 即說明蛋白質體這個字的由來；蛋白質體指在某組織、器官或細胞內所表現之所有蛋白質總稱，蛋白質體的分析研究即稱為蛋白質體學(13)。

     Proteome 這個字是由 genome衍生來的，故與 genome有密切關係。

Genome 是一個細胞染色體上全體基因的總稱，假設這些基因全數表現成蛋白質，此一總體蛋白質即稱為 proteome。

當各物種的 genome 一一被解出之後，我們可以翻出其總體蛋白質，由其所含的蛋白質種類，即可推測該細胞的代謝生理，或者其生理病變。

要記得一個細胞內的總體基因，並不是每一個基因都正在表現，因此一個細胞的 genome 會因表現時期差異而有許多不同的proteomes。

由於 genome及 proteome 都是龐大的資料庫，如何應用電腦以及分析軟體，已成為一專門學科 bioinformatics，日益重要。

      基因定序的工作目前幾乎已經完全自動化，人體的全部基因在 2000 年中期應該可以完全解出來，而水稻的染色體序列，已經被 Monsanto 祕密完成，即將完全公開；對於基因序列的使用，美國與英國已經呼籲應該由人類所共享。

因此，我們應可跳過基因定序的浩大工程，直接開始思考『後基因時期』的新型態研究工作 。

台灣是個小國，電腦科技已有相當的基礎，雖然軟體科技上並不十分成熟，但已經是我們最大的經濟籌碼；如何利用已知的基因序列，加上電腦科技，去找出一條可行的途徑，提升台灣在生物科技界的競爭力，則是我們能否在 21世紀存活的關鍵。

        將來的生物科技，在蛋白質的研究上，會越來越重要，在某些方面可能更甚於對核酸的重視。

為了因應此一趨勢，未來必須著重在蛋白質科技方面的教學與研究，由蛋白質的純化開始，一直到最後的修改與量產，成為純化 →分析 →功能 →構造→改良→量產的完整系列，才能開創蛋白質之相關產業(12)。

      基因體學和蛋白質體學研究的主要差異為何？所謂的基因體學，其實也可以說是「討論儲存在DNA中所有遺傳資訊」的總稱。

基因在經過一連串的作用後產生蛋白質，以成為生物體的結構或是具有調控作用的工具，也因此使得不同的生物體間具有不同的特性。

而蛋白質體學主要是在討論蛋白質的氨基酸排列順序以及蛋白質的立體結構；因為蛋白質的氨基酸排列是由基因所決定，因此基因體學和蛋白質體學之間有著相互的關連性。

      然而在浩瀚的生命科學領域中事情往往並不是如此的單純，事實上是蛋白質存在著三度空間的結構排列，科學家們並無法單獨藉由氨基酸的排列順序就可以推測出蛋白質的真正結構，因此蛋白質體學主要是利用已知或是理論的蛋白質結構資料，進一步去分析和推測未知的蛋白質結構。

一般來說，蛋白質體學的研究囊括了結構生物學 （Structure Biology）、蛋白質表現（Protein Expression）、蛋白質交互作用 (ProteinInteractions)、高速蛋白質體圖譜（High-Throughput ProteomicMapping）、蛋白質改造（Post-translation Modification）和細胞膜蛋白質（Membrane Proteins）等各項專業而相當重要的領域。

科學家們日以繼夜的努力研究目的就是希望能一窺蛋白質的真面目(12)。

  四、研究流程 過去蛋白質體學分析之主要內容，就是分別將不同生物的器官、組織、細胞…等的蛋白質利用二維電泳技術（Two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE）將蛋白質一一分開，然後分析其蛋白質種類、結構資訊，經由電腦軟體分析比對，將資料傳送到著名的SWISS-PROT及PIR-International（Protein InformationResource）…等資料庫中心進行比對。

隨著基因體資料大增、電腦分析處理能力的進步及生物資訊學的發展，蛋白質體學研究才得以成為二十一世紀生命科學研究的新顯學(13)。

  1. 蛋白質檢體製備（Sample preparation） 譬如器官、組織、細胞、血清或微生物...等，只要有蛋白質的成分存在，皆可用來分析；由於蛋白質可執行許多生物功能，因此具有多樣且複雜的物理化學特性；也由於檢體形式及檢體來源差異極大，因此在進行分析前的檢體處理上便極為重要。

  首先我們將器官或組織打碎，將細胞打破，加入適當的試劑（例如8 Murea、4 %CHAPS及DTE...等等），取得欲分析的蛋白質檢體(5)。

  2. 二維電泳分析（Two-dimensional gelelectrophoresis,2-DE） 二維電泳分析（2-DE）可以說是蛋白質體分析的主要技術（core technology），整個二維電泳分析過程.   首先將欲分析的蛋白檢體以等電點聚焦電泳（Isoelectic focusing,IEF）將蛋白質依等電點（pI）進行第一維分離，續將此分離結果使用SDS-PAGE（Sodium DodecylSulfatePolyacrylamidegelelectrophoresis）依蛋白質分子量進行第二維分離；由於經過兩種原理分離蛋白質分子，因此能夠分析非常微量的蛋白質。

      其實二維電泳分析（2-DE）並非新興技術，早在七十年代中期就已經發展出這套電泳分析系統；然而礙於電泳結果再線性不佳，且無法進一步深入分析，因此遲遲未能普及。

直到固定式pH梯度膠片（Immobilized pH-gradientstrip，IPG）及High VoltageprogrammedIEFmachine的出現，提昇解析度及技術上的實用性，才得以大量應用在研究上(7)。

  2.1 第一維：等電點聚焦電泳（Isoelectic focusing,IEF） 蛋白質依本身胺基酸的組成不同，而帶有不同電荷數，亦即有不同的等電點，當外在pH值等於蛋白質本身的pI值時，就達到等電點，此時淨電荷為零，蛋白質即固定不動。

等電點聚焦電泳（IEF）就是使用一種帶有不同酸鹼值（pH梯度）的膠條，依照等電點的不同將蛋白質分離。

     以往IEF電泳之困難點在於必須自行鑄膠，而目前已有商賣改良之「固定式pH梯度膠片（IPG）」，配合廠商開發之電腦化高電壓（8,000至10,000 volts,Max）之IEF電泳系統，第一維電泳部分才得以突破。

  2.2    第二維：SDS-PAGE（Sodium DodecylSulfatePolyacrylamidegelelectrophoresis） 將作用完畢之IEF置入SDS-PAGE膠片上方，利用SDS-PAGE膠片基質（Matrix）中的分子篩（Molecular sieve），將IEF膠條上已初步分離之蛋白質再依分子量（M.W）大小不同而分開(7)。

  3. 電泳膠片染色及影像掃描（Computer scanning） 執行電泳後的SDS-PAGE膠片以適當的染料（如Silver stain、Coomassie brilliantblue或Ruby stain）染色，放入高解析度的掃描器中獲得影像。

SDS-PAGE膠片也可以轉印（Blotting）至Nitrocellulose或PVDF膜上，以免疫化學方法偵測出特定的蛋白質。

  4. 影像分析（Image analysis） 經由高效能影像掃描，再以電腦軟體分析，可以偵測出蛋白點；也可以與正常或已知的蛋白質模組對照，分析彼此的差異點，選出有意義的標的蛋白質（Target protein）進行探討。

  5. 蛋白質點切割（Spots excision） 藉由儀器以機械手臂將欲探討或有意義的標的蛋白質點切割下來，將此蛋白質點進行蛋白質鑑定及胺基酸序列分析。

  6. 蛋白質鑑定（Protein identification） 6-1 質譜儀分析（Mass spectrometry） 蛋白質鑑定以Edman degradation（一種由蛋白質N端至C端方向切割，逐一解出蛋白質胺基酸序列的方法。

）為基礎，來定出蛋白質的胺基酸組成份。

一般可以定出10至40個胺基酸序列。

近年來發展出高效能的質譜儀技術（MALDI-ToF-MS及Q-ToF-MS-MS）能夠精準解析出蛋白質的分子量、序列，推斷出胺基酸片段上的修飾，例如磷酸化、醣化…等等。

  6-2   資料庫比對（Database Comparison-bioinformatics）     經由質譜儀分析的蛋白質與蛋白質資料庫進行比對，得知此標的蛋白質的種類，或有可能是新的未知蛋白，再由此蛋白質進行學理上的探討或應用(13)。

  五、蛋白質體學之應用 隨著各項基因體計畫完成，所有的資訊也會儲存於資料庫當中；這些不同基因體之表現型 (phenotype) 之比較，將會是一個新的里程碑。

過去之研究都是從型態上觀察各個組織細胞間的差異，進而找出不同的基因；在未來則是利用完成定序之各基因體，進而研究其表現於細胞的功能，因此 proteome(蛋白質體)分析也成為蛋白質研究重要課題之一。

  蛋白質體研究以高解析度、高效能的二維電泳（2-DE）、影像分析、質譜儀（MS）結合生物資訊學來分析、定量及鑑定蛋白質。

由蛋白質的分析結果我們可以瞭解蛋白質在細胞內不同位置的表現、調節、活性、功能及交互作用；經由比較各細胞不同發育期之間蛋白質表現的差異性，我們可以探討生物的代謝途徑及致病機轉，找出疾病的病變蛋白質，研發新的診斷標記或進行新藥開發…等等(6)。

以下分別說明蛋白質體研究的應用： 1.    診斷標記（Diagnostic markers）及腫瘤標記（Tumor markers） 1-1感染性疾病 將基因體或是由所取得的檢體利用蛋白質體技術將其展現出來，可以對此生物功能獲得較全面性資訊。

當人類得到某種感染性疾病時，利用被感染者的血液或病變細胞當作檢體，以蛋白質體方法分析與控制組間之差異性蛋白，篩選感染性微生物之標的蛋白質，利用這些標的蛋白質探討其感染及代謝途徑或是製造出診斷性抗體，相信這將成為研究感染性疾病的新標準模式。

      台灣在1998年爆發腸病毒大流行，嚴重威脅台灣民眾的健康及生命安全，即使到今日，腸病毒感染仍是令人聞之色變。

根據調查研究，在台灣腸病毒引起的手口足病（HMFD, Hand-mouth-footdisease）及中樞神經病變，以腸病毒71型（Enterovirus 71）的比例最高；雖然可以利用取病人的血液或腦脊髓液以分子生物學（例如RT-PCR）的方法診斷，也有相關的腸病毒基因晶片來偵測腸病毒；但若能以蛋白質體技術探討病毒在感染過程中表現之標的蛋白質，並利用此標的蛋白質發展預後診斷試劑組（Prognostic kit），建立抗腸病毒71型的藥物篩選模式，相信更有助於腸病毒的治療、診斷及疫情監控。

  1-2   體液性疾病 蛋白質體可以用來分析體液中的特殊蛋白質，蛋白質體學可以用來分析體液中特殊的蛋白，來解說在疾病診斷上之影響，有助於對疾病成因之瞭解、病程之控制與研判預後之結果。

在一些患有腦膜炎、頭部外傷、急性呼吸窘迫、腎功能不足、溶血性貧血或癡呆症病史的病人，這些病史都和體液中總體蛋白質的研究有關，將可用來發展一些較快速簡易的診斷方法。

患有腦膜炎或是頭部外傷的患者，可以取其脊髓液，透過雙向電泳技術來鑑定蛋白質型態，尤其是脊髓液中的血清輸鐵蛋白的後修飾作用。

患有呼吸窘迫的病人，因其胸腔充滿液體而壓迫到氣管，可經由胸腔穿刺吸出該液體後便可減輕患者的症狀，再利用雙向電泳技術分析體液的成分。

但是目前對患有淋巴瘤病人身上的溶血性貧血症則難以偵測出來，因為其免疫球蛋白的輕鏈相當地少；而患有家族性澱粉樣變性的病人，也很難診斷得出腎功能不足，因其許多的單株 IgA 的重鏈被水解之故，這些都可以透過雙向電泳技術來分析檢驗之。

目前對患有快速痴呆症者，可以在其脊髓液中，檢驗發現兩種不正常的蛋白 (命名為 130和 131)，最近被確定為 Taugchain，此為臨床上 CJD 所特有的病徵。

由此更可知蛋白質體學在新的疾病指標或疾病模式的發現上，所扮演的重要角色。

  蛋白質體學的研究也可以幫助我們去尋找新的疾病指標，相信在不久的將來，甚至可在脊髓液或血液中偵測出 prion 蛋白質。

整體性的測量脊髓液中所缺乏的正常腦部蛋白，將有助於監測疾病的進程，更進一步有助於疾病的治療(11)。

    1-3   心血管疾病 擴大性心肌病變（Dilated cardiomyopathy,DCM ）是一種嚴重的心臟疾病，也是現代繁忙的都市人經常罹患的疾病，最後將導致心臟失去功能；病人通常都只能期待換心以維持生命。

運用蛋白質體的方法已經鑑定出心肌中150種蛋白質，比較後發現有25個蛋白質有明顯的差異；經由這些已確認的蛋白質資料庫與病人（或高危險群）的蛋白質做比對，或許可以在疾病產生初期達到早期預防的目的。

  1-4   癌症醫學研究方面 根據衛生署公佈的資料，癌症已經連續多年高居國人十大死因的首位，平均每17.5分鐘就有一個家庭因為癌症而面臨死別的傷痛。

由過去的研究資料顯示，超過50﹪的癌症與p53的變異有關（p53是一種抑癌蛋白質），蛋白質體分析方法能夠分辨出蛋白質分子結構上輕微的變化；經由p53的蛋白質體學研究，更可以釐清p53異常所造成細胞的調節缺陷及凋亡（Apoptosis）的機轉。

      雖然目前在臨床上已經發展出許多腫瘤標記，例如CEA、CA125….等可供利用，但是礙於專一性及準確度不高，並無法十分精確的應用在癌症的診斷上，大多數都用來做為癌症治療及預後的指標；蛋白質體方法進行腫瘤研究可能可以發現新的腫瘤標記並建立腫瘤或癌症的2D資料庫。

     1-4-1 乳癌 (breastcancer) 在比較人類正常乳房組織與惡性乳房癌的蛋白質分佈中，發現兩者之間有專一性的蛋白質差異存在。

在腫瘤細胞中，至少有 22 種蛋白質會不正常的增加，一種蛋白質則會減少。

另外也發現到某些特定的蛋白質的表現與 estrogen與 progesterone 接受器之間有相關連性。

  1-4-2 肺癌 (lungcancer) 肺癌是最具腫瘤性 (oncological) 的疾病之一。

臨床上肺癌的診斷往往已屬晚期。

直至目前為止，並無有效的治療方案可得。

所以任何有助於肺癌診斷或預後的發展都是有助於肺癌的治療方針的。

也因此，有許多的科學家是致力於以雙向電泳技術研究人類肺癌的。

在分析組織病理學上不同種類  (histopathologicaltypes) 的肺癌細胞時，結果發現不同組織病理類型細胞體會有不同的蛋白質表現圖譜。

另外，也發現有一專一性的蛋白質僅會出現在原發性肺腺癌 (primarylungadenocarcinomas)上。

例用此技術將可有效地鑑定出新的腫瘤標誌 (tumormarker)，在鑑別診斷麟狀上皮細胞肺癌與腺癌時有相當大的助益。

  1-4-3 結腸癌 (coloncancer) 結腸癌是一種常見的癌症。

雖然臨床有 Dukes 氏分類與分級法，但對於癌症的發展程度和預後卻仍難評估。

為了尋找新的結腸癌抗原或標誌 (marker)。

利用雙向電泳與免疫轉漬技術，分析自人類結腸癌細胞粗萃取蛋白質中分離出的一系列蛋白質。

並將有意義之蛋白質點 (spot) 切割出，進行蛋白質序列分析以鑑定這些蛋白質。

曾有研究針對人類結腸性疾病，使用單株抗體分析結腸 heatshockprotein 表現的情形，結果發現hsp70 酸性的 isoforms在結腸息肉 (polypous)與惡性組織 (malignanttissues) 中的表現不論是在量上或質上均有相當的差異；此外在慢性發炎性腸炎的黏膜或 Crohn's腸炎組織中則有不同的 hsp70鹼性 isoform被發現。

  1-4-4 腎臟癌 (kidneycancer) 人類的腎臟癌是較少見的癌症，其中源自於近端腎小管上皮細胞的腎細胞癌 (renalcellcarcinoma) 大約占成人惡性腫瘤的 3%。

但如同許多實質性腫瘤般，腎細胞癌發現時期均屬癌症末期，外科手術已難治癒的階段。

並且無適當的腫瘤標誌可參考。

在研究腎臟癌組織的研究中發現有四種蛋白質的表現在腎癌細胞中會消失。

其中有兩種蛋白質分別為 ubiquinolcytochromecreductase,mitochondrialNADH-ubiquinone oxido-reductasecomplexI。

這暗示粒線體功能的缺失在腎細胞癌的發生上扮演種要的角色。

雖然該研究沒有發現特定的標誌蛋白質。

但尚有許多可能與該癌症發生相關的蛋白質仍待被鑑定。

  1-4-5 轉移的潛力與癌症的治療 (metastaticpotentialandcancertreatment) 直至目前為止，評估腫瘤細胞是否具有轉移的潛力仍是不容易。

但腫瘤細胞轉移與否對於治療方針的選擇與預後是相當重要的。

因此轉移潛力的評估是研究的新方向之一。

Schwalke 等人曾利用雙向電泳的策略分析具有轉移潛力的胰臟細胞癌細胞株的蛋白質表現。

同樣的，Osada 等人也以雙向電泳的技術研究 E-cadherin在肝細胞癌 (HCC) 中的肝內轉移性上所扮演的角色為何。

至於癌症治療的發展上，Weinstein 等人曾建立了以 information-intensiveapproach 作為癌症的分子藥理學研究基礎。

主要針對 60種人類的細胞株，分別處理 60,000 種以上的化合物，目的在篩選出能有效抑制細胞株生長的分子。

接著應用雙向電泳分析觀察各種細胞株對各種化合物處理後的蛋白質表現圖譜。

目前約 60 種細胞株的雙向電泳資料庫已被建立。

這不但有助於了解藥理分子對細胞內蛋白質體的整個變化，也將提供癌症治療新方針的依據之一。

  1-5 免疫性蛋白質 (immunogenicprotein) 自整個基因體或是組織中所抽取的粗萃取物，利用蛋白質體學技術將其展現出來，可以對生物現象獲得一全面性的資訊。

最佳的例子便是免疫系統辨認出感染性疾病中的標的蛋白質。

當人得到感染性疾病時，利用其血清來篩選感染性微生物之蛋白質，進而找到主要的致病性蛋白質。

利用這些蛋白質可以製造出強有力的疫苗，相信這將成為研究感染性疾病的標準方法。

這些相關的資訊可以利用雙向電泳圖譜來分析。

另一個相關的領域是在過敏疾病的研究，尤以之花粉的免疫性研究已較清楚，並可對過敏病人進行減敏治療。

此外如醫學上普遍使用的乳膠手套所造成的過敏，研究者可以直接地萃取出重要的致敏性蛋白質，研究其功能與結構並進一步藉由分生技術探討其過敏機制。

作者研究室目前則致力於黴菌及海鮮類致敏性蛋白質之研究，希望未來能發展出控制過敏疾病之新藥物。

  1-6 體液中的醣蛋白     在疾病發生時，常伴隨有醣蛋白的修飾作用發生，如癌症、發炎反應、酒精中毒等等。

雙向膠體電泳可供分析體液或血液中的醣蛋白之一些微異質性 (microheterogenecity)，在最近的研究中，由醣蛋白圖譜鑑定出一些新的醣蛋白，包括 ApoJ,clusterin,SP-40 等四十個蛋白。

同時，結合雙向電泳和 lectinaffinityblotting 的技術也可以讓我們來了解正常人的血漿/血液中醣蛋白的特殊組成或變化，例如分析胎兒和嬰幼兒的血漿/血清蛋白圖譜，並和成人的圖譜比較，則至少有十個不同處被鑑定出來。

  在許多疾病中醣蛋白圖譜的變化是一極具再現性及非常容易操作的方法，例如研究 CDG(carbohydrate-deficientglycoprotein)syndrome 發現所有N-link 醣蛋白多出了一些高 pI值的 isoform，此外研究 CDGsyndrome 病人血清醣蛋白及其在肝中前驅物發現缺乏ApoJ 和血清 amyloidP 蛋白。

這血清醣蛋白圖譜顯示不正常的 isoforms，例如質量下降，並且朝向陰極移動。

此外，研究風濕性動脈炎，心肌梗塞，癌症病人及健康自願者的血清中之 a1 酸性蛋白的微異質性。

經由雙向電泳的分析發現，所有樣品之 a1 酸性醣蛋白的電荷有明顯的差異且在癌症病人中有較高的表現量。

  2        生化毒理及藥理學研究方面 許多生化分子藉著訊息傳導（Signal transduction），經由蛋白質的調節作用，例如磷酸化、去磷酸化、甲基化....等，引發一連串的生化反應；某些藥物在人體內的傳送及代謝也是藉著與蛋白質（例如Albumin）結合來進行；這些代謝機轉及作用模式都非常適合使用蛋白質體學來研究及探討。

將某一特定細胞株經藥物處理後，比較此細胞的蛋白質體在加藥前後的變化，探討此藥物的作用及代謝模式，有助於新藥的開發(11)。

     Weinstein等人針對六十種人類細胞株以60,000種以上的化合物處理，篩選出抑制細胞株生長的分子，並以蛋白質體研究方法觀察各個細胞株在以各種化合物處理後的蛋白質表現圖譜，建立2D資料庫，這除了有助於瞭解藥物對細胞內蛋白質體的變化外，也提供癌症治療的方向。

   2-1 磷酸化作用 (phosphorylation) 在許多的生化反應中，訊息的傳遞是藉由胜汰 (peptide) 的磷酸化或去磷酸化。

某些藥物的藥理功能或是某些毒性物質的致毒性即來自於其可調節或改變這些磷酸化或去磷酸化。

  藥理學和毒理學中，有些研究利用雙向電泳去分析蛋白質磷酸化或去磷酸化，例如 cytokines與 receptors 的相互作用，其間的訊息傳遞包括了數個磷酸化蛋白質。

Bistratene A 可改變人類血癌細胞中蛋白質磷酸化的模式。

許多荷爾蒙可啟動細胞中磷酸化或去磷酸化的訊息傳遞。

在絨毛膜組織中，絨毛膜促性腺激素 (chorionicgonadotropin) 的形成包括了蛋白質的磷酸化。

  2-2  藥物代謝物和運送 (drugadductandvehicles) 藥物或藥物的代謝物，如磷酸根或醣基，可與蛋白質共價結合，改變其一級、二級和三級結構。

為了研究這些效應，必須去鑑定其被修飾過的胜汰。

利用蛋白質体分析是一個很好的研究工具，例如 acetaminophen 為一種普遍使用的止痛藥和退熱藥，其大量使用時會危害肝臟且可能致命，但其m-hydroxy isomer不會危害肝臟，兩者皆可被肝的 cytochromesp450 氧化，與肝的蛋白質共價結合，因此可利用雙向電泳方法研究比較兩者的差異。

  藥物在血液中運輸常常是與蛋白素 (albumin) 或醣蛋白結合。

某些藥物可與之共價結合，因此藥物被吸收利用的量會減少許多，例如 penicillin 會修飾血清中的蛋白素。

為了增強藥物的投遞和改善其運送，必須有藥物攜帶者 (drugcarriers)，如膠狀攜帶者或微小粒子 (nanoparticles)。

利用蛋白質体的方法可有效的追蹤和鑑定血液蛋白質與這些人工合成粒子間的交互作用。

例如利用雙向電泳分析表面以 latex 修飾過的粒子其在血液中被蛋白質吸收的模式。

有些 apolipoprotein在 reticulo-endothelial 系統吸收這些粒子中扮演重要角色，實驗証明這些 apolipoprotein 確實可吸附於微小粒子表面。

  2-3 荷爾蒙 (hormones) 產科學和婦科學中，有些荷爾蒙可用於避孕和不孕上。

科學家利用蛋白質体的方法研究荷爾蒙處理後整體蛋白質的表現情形。

高量的 ethinylestradiol-norgestrel 可用於緊急避孕法，其可有效抑制子宮內黃体酮連結子宮內膜蛋白質 (progesterone-associatedendometrialproteins)，改變子宮內膜的環境使之不合適於早期胚胎的生存。

  3        在農業生物技術方面 由於基因工程技術的發展，高經濟價值的農產品及基因食品大量的被製造及推廣，提昇農業的價值及產能，有助於解決糧食危機。

然而，經由遺傳工程製造出的農產品（或食品）經食用後對人體是否會造成傷害，在人體內是否會產生不良的反應仍有許多值得探討及釐清之處；藉由農業蛋白質體學的研究可以深入的探討複雜的生物農業問題，追蹤基因轉殖品的後續變化，評估對人體及環境生態上所造成的影響。

4. 其它方面   4-1 追蹤複雜 (trackingcomplexity) 蛋白質體學分析法可用來研究寄主-病原菌或寄主-寄生物之間的作用關係。

豆科植物與根瘤菌共生而形成根瘤，以進行固氮作用。

不同菌株具有不同的固氮能力，所以利用蛋白質體學技術可以瞭解何種分子對於固氮作用是最重要的。

另外，可由有無形成根瘤之植物，而找出形成根瘤的相關蛋白質。

於澳洲國立大學得研究顯示，在亞麻感染的模式中發現，具致病性的的真菌其蛋白質有不同的表現情形。

因此，藉由蛋白質體學之研究可以深入地瞭解複雜的生物性課題。

  4-2  提昇農業產品 (improvedagriculturalproducts) 傳統農業是一門經驗性的科學，即使在基因運作的規則尚未被瞭解之前，在植物或是動物的育種方面就已經有高度建構的成就。

於過去的數十年間，在基因轉殖技術的引導下，以使得農業進入了生物技術的革命性時期。

以生物工程的技術增加植物對病原及寄生蟲，如病毒，細菌，真菌或是昆蟲的抵抗力就是一個很好的例子。

相對於 mRNA 的大量表現，大多數的抵抗機制都涉及毒性蛋白或是保護性蛋白的表現。

這些蛋白質的表現對於該保護作用而言是必須的，如馬鈴薯的抗病性。

但如果沒有即時地運用蛋白質體學技術來輔助新的毒性蛋白的發現，或是用來確認植物對於病原可能的抵抗性，也就是在基因轉形的早期階段大量地表現相關的蛋白質，則目前的成就真是一件令人驚訝的事。

以現在許多農產品為例，其高附加價值的本質特性在分子層次上仍未被瞭解，而這樣的表現型可能是起因於多種蛋白質表現的結果，而非單一基因產物所造成的。

以木材為例，其外貌如色澤，纖維強度等都是重要的經濟性特質，可以藉由樹木蛋白質體學技術來確認影響這些特質的相關蛋白質，甚至可以更進一步地發展種子育種或是以分子生物學的方法來改良這些產品。

  4-3  增加農產品價值 (valueaddedagriculturalproducts) 隨著能產品市場的國際化以及產能上的壓力，必須對於農產品的處理程序做一個全盤性的回顧。

從前看來低價值的副產品，在今日全部被重新評估是否具有發展成新產品的潛力。

而已有的產品也同樣地再審視是否有更佳的處理程序。

目前三種最迫切的農業便是酪農業，屠宰業與穀物。

這三類產品在生產的過程中都會產生數以噸計的低價值性副產品，而這些副產品一般不是丟棄就是花錢請其他單位代為處理。

詳細地分析這些副產品的蛋白質成分與利用生物科技來增加其利用價值似乎有點令人驚訝，但這確實是有其必要的！   在酪農業中主要的蛋白質副產品來自於乳酪製造商。

目前利用蛋白質體學技術發現在乳酪中有生長因子的存在，有可能成為具有促進生長的重組蛋白質的產品，或是應用在發展促進傷口癒合的製劑，如各式的潰瘍藥劑。

而這些新的利用價值，甚至可能改變整個乳酪製造業的經濟型態。

  屠宰業在傳統上會收集動物的血，骨頭以及內臟來做為肥料。

但是血清中含有超過兩千種以上的蛋白質，其中已知生理功能的卻僅有數百種而已！因此利用蛋白質體學技術的研究將可能導致許多新高價值蛋白的發現，而賦予肉品業的副產品有更高的價值。

  食品業一直相當重視加工食品，而此類食品的製造需要有溫和不刺激的蛋白質來源。

一般最常使用的是牛奶中的酪蛋白，但是原料價格高。

如果能直接利用穀類來抽取，那將是一個相當可觀的市場。

不過在這之前，應該先徹底的研究穀類蛋白質的特質，才能合理地發展這方面的應用。

目前正研究積極方向的便是雙向電泳技術應用於穀類粗抽蛋白質的分析(11)。

  六、結論 基因体的研究，將使人類生物密碼及表現訊息依序排列出來，如同將英文字母依順序排在一本大字典裏，但是這個是靜態且為潛在 (potential) 訊息，這些基因有的生物功能仍然需積極瞭解。

生物醫學的研究，在 post-genomics 仍有走不完的路。

基因体資料好比給我們一個地圖，實際的風景，要親臨現場才能了解。

我們在病毒學研究歷史上已充分突顯這個限制。

比如 B 型肝炎病毒基因体在二十年前已完全解出，只含四個基因，但二十年後，仍有許多 B 型肝炎的問題未解。

人類基因体有十萬個基因，將要多少年去了解？因此生物醫學研究者不需惶恐，要冷靜思考，如何利用基因体資料加速生物醫學的發現。

  對醫學研究者而言，眼前是一個黃金時代，人類所以產生疾病，有一部分是基因体有天然的變異 (naturalvariation或 diversity)，這可看做廣義的生物多型性或多樣性 (polymorphism)。

而這種特異點遺傳疾病，特別清楚，多半是某一個或幾個基因發生的變異，導致表現型異常。

所以如果能針對遺傳相關的疾病家族，加以分析，決定與基因体那一片斷或區間有密切的連鎖關係，我們就可以利用基因体字典，尋找該區間有的基因，而快速的縮小搜尋範圍，幫忙找到致病基因，這是目前盛行的定位選殖 (positionalcloning) 策略。

  在生物醫學界，如生物學是觀察生物体的歧異性；人類學則是觀察、記錄人類表現型之差異。

而醫學是看人類生理、病理表現型的差異，理論上只要累積足夠的案例，就可以進行與相關基因的連鎖分析 (linkageanalysis)，而幫忙找出目標基因。

這種分析，在單基因或性聯基因的遺傳疾病上，特別有成果。

因此基因体研核心研究室，將建立 泛基因体的連鎖分析 技術。

與臨床醫師合作，如果有良好的臨床案例以及遺傳家族，就可以加以分析，快速的解決問題。

  研究基因的動態（Dynamic）表現，唯有從蛋白質著手，由各物種基因體我們可以推出其蛋白質體的組成，由所含有的蛋白質種類及含量，可以推斷出該生物的生理、代謝情形及病變。

然而每一個基因並不是隨時都在表現的，因此一個細胞在不同發育或生理時期會有不同的蛋白質體。

蛋白質的表現可以是疾病的「原因」，也可以是疾病的「結果」。

      蛋白質體學分析技術具有高產能、廣泛運用的優點，由於電腦資訊科技的蓬勃發展，強大的運算處理能力使的研究實驗結果可以儲存在資料庫中並有效率的進行分析比對，應用到相關的領域中。

蛋白質體研究在後基因體時代（Post-genome era）具有強大的功能，蛋白質有複雜且多樣的化學特性，可執行種種的生物功能，在不同表現時期有不同的蛋白質體；要以二維電泳及質譜儀技術來進行蛋白質體全面性的分析，還需克服部分難題；例如（1）二維電泳對於微量蛋白質的解析能力，（2）簡化檢體的製備過程，（3）能否在最適當的時間點取得欲探討的蛋白質的檢體，（4）實驗上的再現性能否再提高，（5）數據分析處理的能力。

這些都需要不同領域的合作才能夠釐清蛋白質的功能表現。

      藉由蛋白質體學的研究找出疾病的病變蛋白質：由於大部分的人類疾病幾乎都可以在基因上找到根源，因此若能夠標出造成病變基因的位置，也就能夠找出造成病變的蛋白質（marker protein）。

在清楚瞭解病變蛋白質後，就有可能推出該疾病的致病機制，進而可以發展出該疾病的檢測方法，甚至是治療方法。

這是在臨床醫學上的應用(9)。

      除此之外，我們還可以藉由蛋白質體學的研究來推測出目標生物的代謝途徑：檢查一個生物體蛋白質體內的所有蛋白質，進而試著拼湊出其細胞的代謝途徑。

例如當我們發現某病原菌的蛋白質體中有hexokinase（此為糖類代謝中所需的一種酵素），以及其它所有的glycolysis（糖類分解）的酵素，就可以推斷此病原菌具有糖解作用，甚至有其下游的糖類代謝作用等。

如此便可以瞭解該病原菌的整體代謝，並找出其弱點加以攻擊。

  有關檢驗醫學發展的特點，在於將醫學相關的生命科學技術或檢驗之相關成果很快地轉化為檢驗醫學項目而應用於臨床診斷上；蛋白質體分析除了能夠探討生命現象及疾病的發生外，對於檢驗醫學的最大貢獻在於經由比較不同個體間的蛋白質體，找出具有臨床意義或與疾病相關的蛋白質，進而發展出相關的的檢驗試劑及項目，或是與生物晶片結合，製作成蛋白質晶片，運用於臨床檢驗及醫護點（point ofcare）上，這些都是指日可待的(13)。

    七、參考資料   1.  AkhileshPandey,MatthiasMann.Proteomicstostudygeneand genomes.Nature   (2000)Vol405:837-846. 2.  BlackstockWP,WeirMP(1999)Proteomics:quantitativeand physicalmappingof  cellularproteins.Trends Biotech17:121-127SorenNaaby-Hansen,MichaelD. 3.  High-SpeedBiologistsSearchforGoldinProteins.RobertF. ServiceinScience,   Vol.294,pages2074-2077; December7,2001. 4.  JungblutPRetal.,Proteomicsinhumandisease:cancer,heart andinfectious   disease.Electrophoresis. 20:2100-2110. 5.  Lopez,M.F.etal(1999)J.Chromatography722:191-223. 6.  ProteinsRule.ScienticAmerican(April2002)page42-47. 7.SeparationAnxiety:Why ProteomicsCan'tLetGoof2DGels.AaronJ.Senderin    GenomeTechnology,No.16, pages34-39;December2001. 8.WaterfieldandRainerCramer. Proteomics-post-genomiccartographytounderstand   genefunction.Trendsin PharmacologicalSciences(2001)Vol.22:376-384. 9.WilkinsM.R.etal(1997) Proteomeresearch187-231. 10. 生醫報導：追求卓越計畫 -基因體研究核心實驗室的策略 11. 生醫報導：蛋白質體學於生物醫學上之應用 12. 蛋白質當家. 科學人雜誌 4(2002):46-54. 13. 中華民國醫檢會報. 2001.Vol.16.No.5