含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫 ...

含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究,马立克氏病毒;;LTR;;鸡;;鹅;;鸭;;生物安全评价,鸡马立克氏病(Marek's disease, MD)是以淋巴组织 ... 手机知网App 24小时专家级知识服务 打开 畜牧与动物医学 手机知网首页 文献检索 期刊 工具书 图书 我的知网 充值中心 含REV-LTR基因的马立克氏病毒活疫苗的生物安全评价及免疫效力研究 扬州大学 | 杨洋  鸡马立克氏病(Marek'sdisease,MD)是以淋巴组织增生、外周神经麻痹和脏器、肌肉、皮肤肿瘤为特征的肿瘤性传染病,严重危害世界养禽业的发展。

马立克氏病病毒(MDV)在流行过程中,已经从温和型病毒株演进化为强毒株,并出现了超强毒株。

常规疫苗对强毒的免疫保护效果并不理想,对超强毒株免疫保护更是不尽人意。

科学家利用各种方法构建MDV候选疫苗,特别是利用基因工程研发重组疫苗成为当前研究的热点及突破点。

目前有已经分离到多株自然整合有禽网状内皮组织增生症病毒(REV)的长末端重复序列(LTR)的马立克氏病病毒。

最近研究表明REV的LTR可能赋予这种重组病毒某种选择性优势,LTR较强的启动子和增强子作用不仅能增强亲本病毒复制,而且不改变亲本病毒毒力,从而提高疫苗免疫力,这一优势为利用LTR改良马立克疫苗提供了保障。

前期用MDV(JM/102W株)和REV(CSC株)混合感染鸭成纤维细胞(DEF),随后将细胞悬浮液接种于鸡,在鸡的羽毛囊内分离到一株含有LTR的重组马立克氏病病毒,并将该病毒中的LTR的基因片段连接到含有马立克氏病毒同源臂载体B40中,构建了带有LTR的供体穿梭质粒,并与CVI988/Rispens病毒基因组DNA共转染鸡胚成纤维细胞(CEF),在细胞中进行同源重组,产生整合有LTR的CVI988/Rispens重组马立克氏病病毒(rMDV-LTR)。

本研究对rMDV-LTR进行生物安全评价和免疫效力试验,期望得到免疫保护作用好而又安全的重组马立克氏病毒活疫苗,开发一种能作为表达保护性抗原基因的活疫苗载体。

1含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒生物学特性及感染与排毒检测将重组MDV分别通过鸡胚成纤维细胞(CEF)和SPF鸡的连续传代增殖,通过PCR法鉴定LTR基因是否插入,以及确定LTR在IRS和TRS的存在,进一步用测序的方法评价重组病毒插入基因的稳定性。

在1日龄SPF鸡皮下接种重组MDV,通过非免疫同居鸡的羽囊和血液进行病毒分离、PCR检测等评估重组病毒水平传播能力。

对1日龄鸡接种重组MDV后,通过对饲料、饮水、粪便、垫料等的病毒分离、PCR检测评估疫苗毒株在环境中的存活能力,通过对免疫鸡的组织病毒分离、PCR检测等评估重组病毒在免疫鸡体内的分布情况。

试验结果表明重组马立克氏病病毒在CEF生长良好,以50.60PFU/ml的病毒滴度感染CEF细胞,生长曲线结果表明,rMDV-LTR在培养前3d空斑较少,在4d空斑开始增加,在第5d生长速度迅速加快,可持续增长到7d。

相比CVI988/Rispens母本株,在第2d开始出现空斑,从第3d开始匀速生长到第6d生长达到高峰,随着病毒的传代病毒的繁殖能力不会改变。

PCR及测序表明,插入片段LTR基因在传代病毒中稳定存在,且没有基因突变和缺失。

重组马立克氏病毒经SPF鸡体内传代5代后,剖检没有明显肉眼病变,内脏组织结构清晰,没有明显病理变化。

重组MDV接种1日龄SPF鸡,同时以母本株CVI988/Rispens做对照,非免疫同居鸡的组织病毒分离和PCR检测结果表明,重组马立克氏病毒具备向同居非免疫鸡进行水平传播的能力。

排毒检测试验未从饲料、粪便、饮水及棉拭子中分离到病毒,因此重组病毒和CVI988/Rispens具有同样的安全性。

2含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒免疫效力研究将1日龄SPF鸡分成8组,每组20只,皮下免疫0.2mL的重组MDV,剂量分别为500PFU/只、750PFU/只、1000PFU/只、2000PFU/只和3000PFU/只,同时CVI988/Rispens母本株2000PFU/只和3000PFU/只(0.2mL)作为阳性对照,PBS0.2mL作为阴性对照。

接种10天后,各组分别以500PFU/只(0.2mL)的剂量接种vvMDVrMd5.攻毒后的每天跟踪记录各组有无临床症状或死亡情况。

饲养60天后,全部扑杀并剖检观察其病变。

采集疑似MDV病变的组织、脏器,然后每组随机选取5只分别取其组织、脏器做石蜡切片,HE染色,进行病理组织学观察,最后疫苗免疫效力由保护指数来评价。

试验结果表明攻毒对照各组死亡率为85%,其余各组精神、采食和饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。

因此,重组MDV与母本毒株具有相同的免疫保护效力。

3含REV-LTR基因的重组马立克氏病毒对靶动物、非靶动物的安全性评价将含REV-LTR基因的重组MDV、母本病毒CVI988/Rispens与PBS作对照,分别通过皮下注射途径对1日龄敏感雏鸡进行一次单剂量、单剂量重复和一次大剂量免疫的安全性试验,对1日龄雏鸭和1日龄雏鹅最大剂量免疫试验,通过腿部肌肉注射途径对4周龄小鼠进行最大剂量免疫试验。

疫苗免疫后,通过对试验动物的临床观察、生产性能测定、内脏组织器官变化和组织切片检查,评估重组MDV的安全性。

试验结果表明,试验鸡、鸭、鹅和小鼠疫苗接种后,各组精神、采食、饮水正常,内脏组织器官和组织切片的检查均未发现病理变化。

综上所述,重组MDV对靶动物、非靶动物具有良好的安全性。

机　构: 扬州大学 领　域: 畜牧与动物医学； 关键词: 马立克氏病毒； LTR； 鸡； 鹅； 鸭； 生物安全评价； 3 218 查看目录 下载CAJ版(9820K) CAJ阅读器下载 手机阅读本文 下载APP手机查看本文 硕士论文 《扬州大学》 2016年硕士论文 精选好书 查看更多好书 相似文献 期刊 硕士 博士 会议 报纸 参考文献 引证文献 共引文献 同被引文献 二级参考文献 二级引证文献 图书推荐 相关工具书 搜索 登录 注册 充值 文献 期刊 工具书 图书 文集 首页 搜索 客户端 充值 帮助 违法和不良信息举报电话：400-062-8866 举报邮箱：[email protected] ©2022中国知网(CNKI)