蛋白質體定義研究方法未來展望@ min'stery - 痞客邦

蛋白質體學是研究多種蛋白質組成的系統，往往是分析一段序列、再藉由database的比對，推測出它的特性，換句話說，蛋白質體學的焦點，放在「系統」的行為， ... min'stery 跳到主文 [~histranger~] 部落格全站分類：心情日記 相簿 部落格 留言 名片 Aug18Thu200515:19 蛋白質體定義研究方法未來展望 蛋白質體的定義： 以以下三方面討論： 1.      基本定義：蛋白質體（proteome）和蛋白質體學（proteomics）兩個字的由來，並比較傳統的蛋白質研究和現在的蛋白質體學有何不同。

2.      蛋白質體和基因體：舉例說明蛋白質體和基因體包含的範圍。

3.      研究蛋白質體學的重要性：蛋白質體學為什麼是繼基因體學後熱門的課題。

一、基本定義：蛋白質體（proteome）和蛋白質體學（proteomics）是在90年代初期，由MarcWikins和學者們首先提出、相對於基因體（genome）和基因體學（genomics）的新名詞，字尾-omics 本身的意義，代表與生物、生命系統相關的想法及學問。

到了90年代中期，生物化學、分子生物學、細胞生物學方面的學者們，在基因與蛋白質方面的研究成果豐碩，北方墨點法（Northern blots，藉由偵測RNA得知基因表現）和西方墨點法（Westernblots，偵測蛋白質的表現）等實驗方法，也在這個時期有重大進展。

究竟蛋白質體學和傳統生化中的蛋白質學有何不同？簡單地列表比較： 傳統蛋白質學（蛋白質化學） 蛋白質體學 探討個別的蛋白質 探討混合的蛋白質群 完整序列的分析 分析部份的序列 重視結構和功能 主要使用database的比對 屬於結構生物學 較偏於系統生物學 蛋白質化學著重蛋白質結構、功能的研究，例如某一蛋白質的完整序列、三度空間立體結構、這樣的結構如何執行功能、在生理上扮演角色，以及代謝的生化機制。

蛋白質體學是研究多種蛋白質組成的系統，往往是分析一段序列、再藉由database的比對，推測出它的特性，換句話說，蛋白質體學的焦點，放在「系統」的行為，而不是「單一組成」的行為。

二、蛋白質體與基因體： 我們的每一個細胞，都帶有讓我們成為完整個體所必需的訊息，不過並非所有的基因都表現在所有的細胞中。

製造維持細胞基本功能蛋白質的基因，如葡萄醣代謝和DNA合成的相關物質，在所有活體細胞都會表現，但基因產物若是具有特殊功能的，就只在特定的細胞表現，如視紫質只在視網膜感光細胞有，換句話說，每一個器官都有一個「基因體」，「蛋白質體」卻有很多個。

一個蛋白質，就算只是單一基因的產物，也會依細胞的不同而有不同的形態，事實上，大部份的蛋白質都會經不同的修飾，使它們的結構、位置、功能，或是分解速度有所改變。

三、研究蛋白質體學的重要性： 蛋白質是從DNA→mRNA→protein而來，遺憾的是，雖然現今的microarraya技術可以看到mRNA的表現，卻不能代表protein的表現也是如此，因為mRNA的穩定性、轉譯（translation）的效能、都會使基因產生不同的蛋白質，而蛋白質本身的穩定性、turnover的速度，都會影響它的功能，例如許多參與訊息傳導、轉錄因子（transcription factor）調節、細胞週期調控的蛋白質，它們在完成任務後馬上就分解掉，mRNA的表現如何，沒有辦法反應這些變化。

生物體內進行反應的單位以蛋白質為主，並非核酸，所以要了解生命的奧秘，首先就要對蛋白質有深入的了解。

  蛋白質體研究流程如下： 要將蛋白質樣品送入質譜儀（MS）分析，首先要做兩件事，第一，必須將蛋白質分解為較小單位的peptides，這個步驟可以使用蛋白水解酶達成；第二，要將原本非常複雜的蛋白質（或peptides）分離成較不複雜的混合物。

一、待測蛋白質的分離（Analytical proteinseparations） 實際的研究中，我們的樣品通常是一塊組織的切片、一盤培養的細胞、一管細菌培養液，或是一片葉子。

要將細胞組織萃取出的數千種蛋白質分開，有三種主要的方式：1D-和2D-SDS-PAGE以及IEF（isoelectricfocusing），另一種選擇是使用高效能液相層析（HPLC）。

二維電泳，也就是2D-SDS-PAGE，所依據的原理是各蛋白質等電點和分子量的不同，同時進行isoelectric focusing（IEF）和SDSpolyacrylamidegelelectrophoresis。

二維電泳完成後，可以將蛋白質保存於膠體中，直到下一個分析步驟。

二、蛋白質的分解（Protein digestion） 樣品送入質譜儀之前，要先用酵素將大分子的蛋白質切成小片段，這樣有利於儀器作出正確的判斷，因為由6到20個氨基酸所組成的peptides對於質譜儀和database的解讀最為有利。

少於6個氨基酸所組成序列，就很難在database搜尋中找出相符合的結果，多於20個氨基酸的peptides，則是在質譜儀很難獲得序列的正確資訊。

自然界存在上千種已純化出來的蛋白酶，但大部份都只能作少量的純化。

用於蛋白質體研究切割的酶，必須是能在大量純化的同時，又能獲得極純的產物，並且切點明確、性質穩定。

將我們有興趣的蛋白質點從膠體上切出，去染色，加入酵素使其分解成peptides，再將peptides從膠體中洗出，這就是「digestion」。

三、質譜儀的分析和database的搜尋（MSanalysisanddatabasesearching） 將蛋白質混合物以2-D電泳分開後，惟有用影像分析方式，才能知道蛋白質是否產生表現量的變化，但是這樣的分析並不足以讓人鑑定出蛋白質，要辦到這一點，必需使用質譜儀（mass spectrometry），分析膠體上蛋白質形成的點。

將蛋白酶切割後的產物送入質譜儀，可測出peptide的質量（mass），接著利用生物資訊的方式，比對database後，可以找出符合的氨基酸組成。

透過質譜儀分析，除了可以得知氨基酸序列，也可以獲得簡單的蛋白質結構，像是雙硫鍵的存在、轉錄後的磷酸化、乙醯化或醣化修飾。

知道待測蛋白質的組成和一些結構的資訊後，便能推測它可能具有的功能。

目前有兩種設備用於蛋白質體學的質譜儀（MS）實驗，一種是MALDI-TOF MS（matrix-assisted laserdesorptioninoization-timeofflightmassspectrometry），一種是ESI-tandemMS（electrosprayionization-tandemmass spectrometry），前者可獲得peptide質量的資訊，後者可獲得peptide片段詳細的資料。

雖然兩種操作的方式截然不同，但得到的結果都具有高度準確性，專門研究蛋白質體學的實驗室，會將兩種皆列為必要的設備。

MS本身有三個主要部份，第一個部份是來源（source），由樣品產生離子；第二個部份是質析（massanalyzer），依離子質量/價數【mass/charge（m/z）】的比例分開它們；第三個部份是偵測（detector），也就是massanalyzer的結果。

簡單說來，質譜儀就是將一群混合物轉為離子，再依照m/z分析它們，得到的結果由儀器自動記錄下來，交給電腦分析。

MS有三個重點，第一是敏感度（sensitivity），多數的蛋白質體研究中，所能得到的蛋白質量都有限，所以儀器最好能敏感到能偵測10-15莫耳的peptide；第二是解析能力（resolution），從極小的m/z值分辨不同離子，最好能區別m/z值差別在0.001amu以下的樣品，限於經費，這樣的儀器其實不普遍，常用的大概在1Da（一個氫原子的質量）左右；第三是精密度（massaccuracy），測得的peptide離子或片段愈接近真實狀況愈好。

如下圖所示： A： 將待測物peptides與一些化學物質（圖中的matrix）混合，matrix中的微小分子，會吸收特殊波長的光。

混合物置於小玻片上，讓水份或其它溶劑揮發到空氣中，造成樣品內部晶格（crystallattice）的形成，再把樣品放到source的部份，source這兒提供雷射光，matrix的化學物質吸收光子而激發電子，釋放的能量轉到樣品中的peptide上，離開matrix表面進入空氣中。

這樣的離子化過程，依樣品的性質，產生正離子或負離子，在蛋白質體學的研究中，通常正離子是我們所感興趣的部份，正離子的產生是在脫離matrix的過程中，接受了質子所致。

每一個peptide分子會接受單一的質子，因此，大部份的peptide離子都會帶一個正電，比如一個質量1032的peptide接受了一個質子後，m/z質成為1033。

在MALDI形成這樣的離子後，再送入TOFmassanalyzer分析。

  B： TOF（timeofflight）正如其名，能測得離子由analyzer一端到另一端（detector）的時間，m/z值愈大，時間愈短。

MS的優劣是在於能區別離子間微小m/z的差異，但是這種測量直線行進速度的TOF解析力不夠高，造成直線型TOF低解析力的原因，在於相同m/z值的離子，直線行進速度也有快慢之別。

C： 改良式的TOF，以反射取代直線法。

它能使離子經反射而聚焦，擁有相同m/z值的離子便會在同時抵達偵測器。

另一種改善直線型TOF缺點的方法是，使用間歇性雷射光讓樣品離子化，如此一來會延遲它們進入TOF的時間，使所有離子的起跑點一致，相同m/z值的就會在相同時間到達偵測器了。

改良後的MALDI-TOF能區別m/z值只差0.001amu的樣品。

MALDI的優缺點： 世上並沒有完美的MS機種，但是MALDI-TOF MS有下列優勢：第一，操作簡便，它的操作介面人性化，使用者較易上手，是所有MS中最容易學會的一種，它可以在一天之內分析上百件樣品。

第二，需要大量製備蛋白質樣品的地方，目前從2D 電泳膠體的製作、蛋白質點（proteinspots）的取出及酵素水解，都採用自動化的設備，MALDI-TOF也能以這樣的形式存在，減少人力、提高效率。

第三，隨著TOF分析方式的改良，得到的蛋白質體數據也愈正確。

第四，MALDI-TOF MS的靈敏度高，可以偵測到少量的（可到10-18mole）蛋白質。

雖然MALDI-TOFMS有這麼多好處，有時我們仍會使用其它種類的MS，這是因為MALDI-TOFMS可以提供正確的「質量（mass）」資訊，卻不能獲得詳細的「序列（sequence data）」結果。

除此之外，分析的成敗，幾乎取決於樣品當初製備的品質如何，如果樣品在水解過程被金屬、鹽類、尿素、丙醇污染，或是界面活性劑（detergen）沒有去除乾淨，都會使樣品在MALDI source的電離（ionization）受到極大的影響。

當然，樣品的污染會影響所有的MS分析，不過MALDI-TOFMS對此特別敏感，因為它沒有再經HPLC系統去除雜質的步驟。

而在未來，蛋白質體的應用將於多方面發展。

未來人類要完全解開生命奧祕，並尋找出具有功能的基因，將有賴於在蛋白質學上的繼續專研，同時對新藥的開發也構成加速效果。

隨著人類基因體圖譜的解開，生命科學與醫藥開發將以二十世紀的基因體研究為基礎邁向二十一世紀的蛋白質體以及系統生物學的世紀。

未來人們對於新藥有更多的期待，醫藥的發展也將從過去的一體適用改變成個人化藥物，研究人員甚至可能將生活飲食習慣與疾病之間的關係解開，尋找到個人化的保健模式，人類的生活將全面改觀。

工研院生醫中心主任蘇新森博士表示，希望運用其在蛋白質體技術，結合基因體研發計畫及臨床醫學中心之資源，致力蛋白性生物標記開發！「生物標記」為疾病偵測及追蹤的重要工具，也是分子診斷的瓶頸所在。

目前臨床應用之診斷用生物標記，其靈敏度大多不高，專一性不佳，導致臨床診斷的結果無法給予醫師或病患足夠的醫療資訊，因此開發高靈敏度及高專一性的疾病分子標記，不僅為臨床診斷醫學需求迫切，也為生醫中心現階段的發展重點。

利用蛋白質體技術開發出新的生物標記，可加速驗證及商品化開發，亦可協助國內生技業發展分子診斷工具或新藥開發。

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