研究凝血酶調節素細胞質功能區參與細胞-細胞間黏著的可能角色

Mei-Shing Chen · 研究凝血酶調節素細胞質功能區參與細胞-細胞間黏著的可能角色 · Investigating the putative role of thrombomodulin cytoplasmic domain on cell-cell ... 資料載入處理中... 跳到主要內容 臺灣博碩士論文加值系統 ::: 網站導覽| 首頁| 關於本站| 聯絡我們| 國圖首頁| 常見問題| 操作說明 English |FB專頁 |Mobile 免費會員 登入| 註冊 功能切換導覽列 (165.22.106.144)您好！臺灣時間：2022/09/0418:11 字體大小：       ::: 詳目顯示 recordfocus 第1筆/ 共1筆  /1頁 論文基本資料 摘要 外文摘要 目次 參考文獻 紙本論文 論文連結 QRCode 本論文永久網址: 複製永久網址Twitter研究生:陳美欣研究生(外文):Mei-ShingChen論文名稱:研究凝血酶調節素細胞質功能區參與細胞-細胞間黏著的可能角色論文名稱(外文):Investigatingtheputativeroleofthrombomodulincytoplasmicdomainoncell-celladhesion指導教授:吳華林指導教授(外文):Ha-Linwu學位類別:碩士校院名稱:國立成功大學系所名稱:生物化學研究所學門:生命科學學門學類:生物化學學類論文種類:學術論文論文出版年:2005畢業學年度:93語文別:中文論文頁數:95中文關鍵詞:凝血酶調節素、細胞質功能區、黏著外文關鍵詞:thrombomodulin、cytoplasmicdomain、adhesion相關次數: 被引用:0點閱:140評分:下載:0書目收藏:0 　　凝血酶調節素(Thrombomodulin,TM)是一種表現於血管內皮細胞表面的醣蛋白，主要的功能是藉著結合凝血酶而活化蛋白質C進而達到抑制凝血反應。

TM基因轉譯出557個胺基酸，其蛋白質結構從氮端依序被分為lectin-like結構區,EGF-like結構區,serine/threonine-rich結構區,transmembrane結構區及碳端的cytoplasmic結構區。

在先前的研究中，將突變的TM基因轉染至黑色素瘤細胞中顯示了TM基因調節細胞的生長速率是同時需要完整的lectin-like結構區及cytoplasmic結構區。

因此我們認為TM的cytoplasmic結構區可能參與一些生理的功能。

本篇研究中，我們觀察到在穩定表現TM基因的人類黑色素瘤A2058細胞中，細胞是以很緊密相鄰的群落型態聚集生長，而且TM會明顯地聚集在細胞間的邊界上。

相反的，在穩定表現缺失TMcytoplasmic結構區基因的人類黑色素瘤A2058細胞中，細胞是獨立分散生長且失去了細胞與細胞間的黏著，這暗示著TMcytoplasmic結構區有參與調節細胞與細胞間黏著的角色。

再更進一步，TMcytoplasmic結構區顯示有四個可能發生磷酸化的胺基酸位置包括534Tyr,540Ser,550Thr,及553Thr，還有經由電腦軟體預測出含有PDZ蛋白結合的位置、WW蛋白結合的位置以及PKC磷酸化的位置；我們已藉由定點突變的方式將上述的胺基酸突變來分析它們對細胞形態的影響；我們注意到在PDZ蛋白結合位置上542Glu以及WW蛋白結合位置上兩個threonine(550,553)對於維持細胞聚集的形態是很重要的。

除此之外，藉由MTTassay分析HEK293細胞的生長速率，發現表現野生型TM1.7的細胞其生長速率比起表現TM△lec,TM△Cyt及空白載體的HEK293細胞慢了許多，顯示TMlectin-like結構區及cytoplasmic結構區對於調節細胞生長扮演很重要的角色。

最後，pERK以及PKC訊息傳遞路徑在表現TM的細胞中似乎有參於調節的角色。

　　Thrombomodulin(TM)expressesonendothelialcellsurface,andfunctionsasathrombinreceptortoinhibitprocoagulantreactionofthrombinbyactivationofproteinC.TMgeneencodes557aminoacids,consistingoffivedistinctdomainsincludingN-terminallectin-likedomain,sixepidermalgrowthfactor-like(EGF-like)domain,serine/threonine-richdomain,transmembranedomain,andanintraceullarcytoplasmictail.Inpreviousstudy,transfectionofmelanomacellswithmutatedTMconstructsindicatedthattheeffectofTMonproliferationrequiredintactcytoplasmicandextracellularN-terminallectin-likedomain.Itispossiblethatthecytoplasmicdomainparticipatesinsomephysiologicalfunctions.Inthisreport,weobservethatTM-expressedA2058cellsgrowascloselyclusteredcolonies,withTMlocalizedprominentlyintheintercellularboundaries.Conversely,TMdetectedcytoplasmicdomain-expressedA2058cellsgrowsinglywithloosecell-celladhesion.ItimpliesthatTMcytoplasmicdomainplaysaroleinregulatingcell-celladhesion.Furthermore,TMshows4potentialphosphorylatedsitesincludingonetyrosine534,oneserine540,andtwothreonine(550,553),acomputerpredictedPDZproteinbindingsite,WWproteinbindingsiteandaproteinkinaseCphosphorylationsiteonitscytoplasmicdomain.Weanalyzetheroleoftheseresiduesoncellmorphologybysite-directedmutagenesis.Wenoticethatglutamineacid542inthePDZbindingregionandthreonine(550,553)inWWbindingsiteareimportantinaffectingcell-celladhesionmorphology.Furthermore,theproliferationratesofHEK293celllinesareperformedbyMTTassaythatresultshowsthatwildtypeTM1.7-expressedHEK293cellswithadecreasedgrowthratethanHEK293-△lec,△cyt,andvectorcontrol.ItsuggeststhatTM’slectin-likedomainandcytoplasmicdomainplayanimportantroleinregulatingcellproliferation.Finally,pERKandPKCsignalingpathwayseemtoplayaroleinmodulatingTM-expressedcell’sfunction. 中文摘要...........................................1英文摘要...........................................3誌謝...............................................5目錄...............................................6表、圖目錄..........................................8附錄目錄...........................................9縮寫檢索表.........................................10儀器...............................................12藥品...............................................15序論...............................................19一.人類凝血酶調節素---------------------------------19二.人類凝血酶調節素的結構與功能---------------------20三.凝血酶調節素與細胞生長---------------------------22四.凝血酶調節素與細胞間的黏著-----------------------23五.凝血酶調節素細胞質結構區的功能性分析-------------24六.研究動機與目的-----------------------------------27實驗方法...........................................28一.小量質體抽取-------------------------------------28二.構築質體之方法-----------------------------------29三.細胞培養方法-------------------------------------35四.穩定性DNA轉染系統(Stabletransfection)-------------38五.以西方墨點法確認TM蛋白表現----------------------40六.MTTassay-----------------------------------------45七.Co-immunoprecipitation---------------------------46結果...............................................49討論...............................................59參考文獻...........................................64結果圖表...........................................68表.................................................88附錄...............................................89自述...............................................95 1BajzarL.Thrombinactivatablefibrinolysisinhibitorandanantifibrinolyticpathway.ArteriosclerThrombVascBiol.20:2511-8(2000)2BoffaMC,BurkeB,HaudenschildCC.Preservationofthrombomodulinantigenonvascularandextravascularsurfaces.JHistochemCytochem.35:1267-1276(1987)3BrozeGJJr,HiguchiDA.Coagulation-dependentinhibitionoffibrinolysis:roleofcarboxypeptidaseandtheprematurelysisofclotsfromhemophilicplasma.Blood88:3815-23(1996)4CollinsCL,OrdonezNG,ScharferR,CookCD,XieSS,GrangerJ,HsuPL,FinkL,HsuSM.Thrombomodulinexpressioninmalignantpleuralmesotheliomaandpulmonaryadenocarcinoma.AmJPathol.141:827-833(1992)5ConwayE,NowakowskiB,Steiner-MosonyiM.Thrombomodulinlackingthecytoplasmicdomainefficientlyinternalizesthrombinvianonclathrin-coated,pit-mediatedendocytosis.J.CellPhysiol.158:285-98(1994)6ConwayEM,PollefeytS,CollenD,Steiner-MosonyiM.Theaminoterminallectin-likedomainofthrombomodulinisrequiredforconstitutiveendocytosis.Blood89:652-61(1997)7ConwayEM,VandeWouwerM,PollefeytS,JurkK,VanAkenH,DeVrieseA,WeitzJI,WeilerH,HellingsPW,SchaefferP,HerbertJM,CollenD,TheilmeierG.Thelectin-likedomainofthrombomodulinconfersprotectionfromneutrophil-mediatedtissuedamagebysuppressingadhesionmoleculeexpressionvianuclearfactorkappaBandmitogen-activatedproteinkinasepathways.JExpMed.196:565-77(2002)8deMunkGA,ParkinsonJF,GroeneveldE,BangNU,RijkenDC.Roleoftheglycosaminoglycancomponentofthrombomodulininitsaccelerationoftheinactivationofsingle-chainurokinase-typeplasminogenactivatorbythrombin.Biochem.J.290:655-9(1993)9DeBaultLE,EsmonNL,OlsonJR,EsmonCT.Distributionofthethrombomodulinantigenintherabbitvasculature.Lab.Invest.54:172-8(1986)10EsmonCT.Thrombomodulinasamodelofmolecularmechanismthatmodulateproteasespecificityandfunctionatthevesselsurface.FASEBJ.9:946-55(1995)11EsmonCT,EsmonNL,HarrisKW.Complexformationbetweenthrombinandthrombomodulininhibitsboththrombin-catalyzedfibrinformationandfactorVactivation.J.Biol.Chem.257:7944-7(1982)12HondaG,MasakiC,ZushiM,TsurutaK,SataM.TherolesplayedbytheD2andD3domainsofrecombinanthumanthrombomodulininitsfunction.J.Biochem.118:1030-6(1995)13HondaG,MasakiC,ZushiM,TsurutaK,SataM.TherolesplayedbytheD2andD3domainsofrecombinanthumanthrombomodulininitsfunction.J.Biochem.118:1030-6(1995)14HungAY.PDZdomains:structuralmodulesforproteincomplexassembly.JBiolChem22;277(8):5699-702(2002)15HuangHC,ShiGY,JiangSI,ShiCS,WuCM,YangHY,WuHL.Thrombomodulin-mediatedcelladhesion:involvementofitslectin-likedomain.J.Biol.Chem.278:46750-9(2003)16JeanPB.ERBIN:abasolateralPDZproteinthatinteractswiththemammalianERBB2/HER2receptor.NatureCellBiology2,407-414(2000)17KokameK,ZhengX,SadlerJE.Activationofthrombin-activablefibrinolysisinhibitorrequiresepidermalgrowthfactor-likedomain3ofthrombomodulinandit’sinhibitedcompetitivelybyproteinC.J.Biol.Chem.273:12135-9(1998)18KoyamaT,ParkinsonJF,AokiN,BangNU,Muller-BerghausG,PreissnerKT.Relationshipbetweenpost-translationalglycosylationandanticoagulantfunctionofsecretablerecombinantmutantsofhumanthrombomodulin.Br.JHaematol.78:515-22(1991)19KurosawaS,GalvinJB,EsmonNL,EsmonCT.Proteolyticformationandpropertiesoffunctionaldomainsofthrombomodulin.J.Biol.Chem.262:2206-12(1987)20MizutaniH,OhyanagiS,HayashiT,GrovesRW,SuzukiK,ShimizuM.Functionalthrombomodulinexpressiononepithelislskintumoursasadifferentiationmarkerforsuprabasalkeratinocytes.Br.J.Dermatol.135:187-93(1996)21PolgarJ,LerantI,MuszbekL,MachovichR.ThrombomodulininhibitstheactivationoffactorXIIIbythrombin.Thromb.Res.43:685-90(1986)22RaifeTJ,LagerDJ,PetersonJJ,ErgerRA,LentzSR.Keratinocyte-specificexpressionofhumanthrombomodulinintransgenicmice:effectsonepidermaldifferentiationandcutaneouswoundhealing.J.Investig.Med.46:127-33(1998)23SanduskyG,BergDT,RichardsonMA,MyersL,GrinnellBW.Modulationofthrombomodulin-dependentactivationofhumanproteinCthroughdifferentialexpressionofendothelialSmads.J.Biol.Chem.277:49815-9(2002)24Schenk-BraatEA,MorserJ,RijkenDC.Identificationoftheepidermalgrowthfactor-likedomainsofthrombomodulinessentialfortheaccelerationofthrombin-mediatedinactivationofsingle-chainurokinase-typeplasminogenactivator.Eur.J.Biochem.268:5562-9(2001)25ShengM,SalaC.PDZdomainsandtheorganizationofsupramolecularcomplexes.AnnuRevNeurosci.;24:1-29(2001)26ShiraiT,ShiojiriS,ItoH,YamamotoS,KusumotoH,DeyashikiY,MaruyamaI,SuzukiK.Genestructureofhumanthrombomodulin,acofactorforthrombin-catalyzedactivationofproteinC.J.Biochem.103:281-5(1988)27SonyaWS.IIp45,aninsulin-likegrowthfactorbindingprotein2(IGFBP-2)bindingprotein,antagonizesIGFBP-2stimulationofgliomacellinvasion.ProcNatlAcadSci100(24):13970–13975(2003)28StrickerNL.PDZdomainofneuronalnitricoxidesynthaserecognizesnovelC-terminalpeptidesequences.NatBiotechnol15(4):336-42(1997)29TamuraA,MatsubaraO,HirokawaK,AokiN.Detectionofthrombomodulininhumanlungcancercells.AmJPathol.142:79–85,(1993)30TeasdaleM,BirdC,BirdP.Internalizationoftheanticoagulantthrombomodulinisconstitutiveanddoesnotrequireasignalinthecytoplasmicdomain.ImmunolCellBiol.72:480-488(1994)31TonyN.EzrinisadownstreameffectoroftraffickingPKC-integrincomplexesinvolvedint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 國圖紙本論文 連結至畢業學校之論文網頁點我開啟連結註:此連結為研究生畢業學校所提供，不一定有電子全文可供下載，若連結有誤，請點選上方之〝勘誤回報〞功能，我們會盡快修正，謝謝！ 推文 網路書籤 推薦 評分 引用網址 轉寄                                                                                                                                                                                                                    top 相關論文 相關期刊 熱門點閱論文 無相關論文   1. 9. 柳文成、胡通哲、謝文雄（2004），「溪流生態工法之規劃－以霧社溪為例」，聯合學報第二十四期，p73-104。

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