Cell culture | 細胞培養 - 泓佑生物科技有限公司ACE Biolabs

Cell culture | 細胞培養每個實驗室都會進行細胞培養，看起來細胞培養非常簡單，但是實際上卻有許多注意事項。

以前研究所時，老師曾經告訴我們， ... 首頁 CellCulture Cellculture|細胞培養2019/05/08 Cellculture|細胞培養 每個實驗室都會進行細胞培養，看起來細胞培養非常簡單，但是實際上卻有許多注意事項。

以前研究所時，老師曾經告訴我們，要把細胞當作「男/女朋友」，要了解他/她的需求、要每天噓寒問暖和細心呵護。

也許聽起來很誇張，但是對於新進實驗室的菜鳥們，細胞培養的確是一大難題。

了解細胞 開始進行實驗前，必須先了解細胞的種類和培養條件，才能夠先對目標細胞有基本的認識，以及準備細胞需要的環境。

  細胞種類 開始實驗前，必須先要了解細胞的身分，包含來源(人類或老鼠)、組織來源(肝臟或肺臟)、細胞型態(圓球、紡錘或完全貼平)等等。

尤其是細胞的型態，用來確認細胞培養時，細胞是否生長良好。

  選擇培養皿 確認好細胞的身分和培養液後，接下來要選擇細胞住的房子——細胞培養皿。

實驗室看到的細胞培養皿並不是簡單的無菌塑膠而已，貼附的過程為，細胞首先分泌細胞外基質，這些蛋白質黏附在培養皿的表面，然後細胞才透過細胞膜和細胞外基質的作用黏附到培養皿底部。

因此，除了細胞本身的特性之外，也和培養皿表面結構有關。

以前最早的細胞培養皿材質為玻璃，但是因為不容易清潔乾淨，以及細胞貼附效果不好，通常需要表面塗層處理，因此後來改用拋棄式的塑膠。

使用的塑膠材質為polystyrene，為有苯環的長碳鏈，優點在於其光學透明性、容易塑模以及可以使用輻射殺菌。

缺點卻是它非常疏水，因此會經過尖端放電或是氣體電漿處理，產生的高能量氧原子作用在polystyrene上，產生大量的羥基和羰基，而增加親水性。

後來更加上合成的polymerpoly-lysine，提高生物相容性，增加細胞貼附和生長。

市面上的細胞培養皿沒有太大差別，都可以購買使用，只不過有不同大小的培養皿，依實驗需求購買，切記不要把10cmdish和petridish、96wellplate和ELISAplate搞混。

有些實驗者會自己再黏附上collagenTypeI,fibronectin,vitronectin等，增加細胞貼附能力。

更有趣的是，有些實驗反而會需要細胞不要貼附，就會需要購買ultralowculturedish，這類的培養皿經過別的處理，使得表面更疏水，而使蛋白質更不容易吸附。

另外，隨著組織工程的進展，開始出現立體的培養基，使研究者更能模擬出細胞在組織間的作用關係，加上3D列印技術的革新，許多實驗室自己就能做出目標結構的培養基。

  選擇培養液 每種細胞有自己適用的培養液，通常可由網路上ATCC查詢，或是參考網友介紹也可。

現在大多使用「合成培養基」，合成培養基是用化學合成方式取代天然萃取，可以確認每一種營養的濃度，確保每次使用品質皆相同。

基本上包含鹽類、胺基酸、維生素等營養物質，通常適用於大部分的細胞。

實驗室最常使用的是DMEM(Dulbecco’smodifiedMinimalEssentialMedium)和RPMI-1640，DMEM還有分成低糖(1000mg/L)和高糖(4500mg/L)，還有DMEM/F12為DMEM和F121:1混合。

不過有些天然成分不容易用化學成分取代，所以通常還是會加入天然培養基，才能維持細胞的健康，現在普遍使用胎牛血清(FBS)，比例為5-20%，最常用的是10%。

培養液有分成液態和固態粉末，液態的好處在於買來時即完成殺菌，可以直接使用，但缺點是保存時間較短；固態粉末保存時間較長，比較節省空間，價格也比較便宜，但是必須要自行配置，並且完成滅菌。

兩者都是於4oC避光保存，應避免凍於-20oC，解凍時可能會有營養成分析出，影響培養效果。

另外，由於培養液含營養物質，在高溫下會失去活性，因此不能使用高壓高溫滅菌，通常使用過濾的方式去除微生物。

需要注意的是，用來盛裝的血清瓶本身需要經過仔細清潔，高壓高溫滅菌後烘乾，才能夠放心盛裝過濾後的培養液。

細胞培養液通常採用NaHCO3-CO2緩衝系統，因此固態粉末的培養基需要按照包裝上說明添加碳酸氫鈉，而細胞培養箱也會另外給予5%CO2，穩定培養液的酸鹼值。

另一種常見的緩衝液為HEPES，為一種非離子兩性緩衝液，通常添加濃度為10-25mM。

另外，有些培養液會添加酚紅作為酸鹼指示劑，提供實驗者判斷培養液的酸鹼值。

當培養的細胞數過多，會導致細胞大量排放代謝廢物到培養液中，而代謝廢物通常呈酸性，因此培養液會變成黃色，實驗者看到黃色即知道要更換培養液，或是繼代細胞。

不過有些細胞實驗不適合添加酸鹼指示劑，市面上也可購買無色的培養液。

亦可參考各種培養基的種類與應用。

  選擇血清 儘管科學家使用化學合成方式組合出了「合成培養基」，但是依然會額外添加「天然培養基」，現在實驗室普遍使用的天然培養基就是胎牛血清(FBS)，血清中含有各種血漿蛋白、多肽類、生長因子、激素等營養成分，這些都不容易用化學合成取代。

胎牛血清優點在於營養成分豐富，培養細胞效果良好，可適用幾乎所有細胞。

但是缺點在於成分複雜，批次間差異非常大，有時還有可能有病毒汙染，近年來因為人道主義等原因價格更是不斷上漲。

由於血清批次間差異大，所以建議先訂購不同批次一瓶，測試有無汙染以及細胞生長情形，確認其效率後再統一訂購大量的同樣批次。

另外，ACEBiolabs提供Specsure®BovineGrowthSerum(BGS) 是以小牛血清為基底的專利配方，額外添加其他營養成分，價格較便宜，且品質較穩定。

血清需要存放於-80oC長久保存，可暫放4oC。

對於大體積包裝，建議可以分裝使用。

一般購買的血清均以經過無菌處理，而肉眼可見的懸浮物為蛋白質沉澱，可用離心或0.45um過濾去除。

若想要進行無菌過濾(0.22um過濾膜)，則千萬不要直接過濾，蛋白質沉澱會阻擋住孔洞，造成堵塞，必須先去除蛋白質沉澱後再行過濾。

血清解凍應該於4oC搖晃一到兩天，一定要均勻規則地搖晃，使溫度變化統一，避免沉澱產生。

切記不要直接拿去37oC解凍，過大的局部溫差變化會導致大量沉澱產生，降低營養成分。

通常實驗室會將血清heat-inactivation，步驟為已經完全溶解的血清經過56oC處理30分鐘，目的在於去除補體活性。

近年來，細胞治療蓬勃發展，培養的細胞會需要打回人體，因此實驗者需要盡量排除異種來源的產物，而研發出了人類血小板裂解濃縮液(humanPlateletLysate,hPL)。

人類血小板裂解液可以提供無異種來源的培養環境(xeno-free)，不會有異種蛋白質造成的免疫反應，其培養效果和胎牛血清相當。

不過因為也是天然培養基，所以成分也是無法確定，而且可能會有人類的細菌病毒汙染問題，因此需要選擇值得信賴的供應商。

需要注意的是，並不是所有細胞都同時適用不同種類的天然培養基，因此若實驗者有意願更換，需要嚴謹的測試，檢測細胞型態、生長速率，甚至是基因表現和DNA甲基化分析。

  抗生素添加 很多實驗室為了預防細菌汙染，常會添加抗生素，最常用的就是penicillin和streptomycin，ACEBiolabs即提供Penicillin-StreptomycinSolution(100X)(ACEBiolabs,CC1009)。

其實一般細胞培養不需要添加抗生素，某些實驗甚至會要求不要添加(如慢病毒包裝)；不過有些特殊實驗需要添加，像是從新鮮的組織中分離特殊細胞，由於一開始來源無法確定無菌，所以必須添加多種抗生素。

細胞汙染最明顯的特徵就是上清液混濁、培養液變色、細胞大量死亡，有些甚至會出現油油的感覺，一旦發現細胞汙染，則切記將其拿到細胞房外處理，不要傾倒於細胞房內水槽，避免汙染擴散。

使用的培養液和其他用品都要經過測試，找出汙染源並仔細清潔。

最麻煩的汙染是黴漿菌(或稱為支原體)，黴漿菌為無細胞壁的原核生物，細胞型態不固定，大小0.2-0.3um，因此有一定機率通過0.22um過濾膜，造成細胞汙染。

由於沒有細胞壁，因此可以對抗部分抗生素，需要使用特別的抗生素才行。

感染的細胞不會死亡，沒有明顯的特徵，但是培養液可能容易變色，細胞生長緩慢，顯微鏡高倍觀察下，還可以看到奇怪的小黑點。

一般檢測的方法使用聚合酶連鎖反應(PCR)，偵測黴漿菌的特定DNA片段，以電泳確認，通常直接取培養幾天細胞的上清培養液即可。

ACEBiolabs提供MycoplasmaDetector(ACEBiolabs,CM1001)，不需要跑電泳，僅通過肉眼觀察顏色變化即可，還附上positivecontrol做顏色的比對。

  其他添加 有些細胞會有特殊需求，如glutamate、growthfactor等等，實驗室舊有的細胞按照實驗室習慣培養，而新的細胞需要於網路上查詢，添加建議的營養。

有些細胞於官網(如ATCC)會建議過多或是過於昂貴的添加物，此時可查詢一般網頁，或是可先嘗試一般的培養條件，如果細胞生長情況皆正常(型態和生長速度)，則可以改用其他條件。

  無菌操作注意事項 確認好細胞種類和培養環境需求後，開始進入實驗室操作，首先要注意的就是「保持乾淨」，因為一不小心就有可能將數個月的心血全部白費。

通常實驗室會有一間「細胞房」，擺放細胞專用的一些設備，包含離心機、自動吸量管(autopipette)、微量吸管(pipetman)等，避免和細菌實驗共用設備而導致汙染。

需要特別注意細胞操作檯、細胞培養箱和二氧化碳鋼瓶。

進入細胞房後，先戴上手套，以70%酒精擦拭後才開始進入操作檯操作。

過程中若有移動到外面，接觸操作檯以外物品，皆需要以70%酒精擦拭，保持乾淨。

細胞房定期(建議每周)擦拭操作檯外面桌面和地板，並開啟細胞房UV，照射消毒一個晚上。

  細胞操作檯 細胞操作會在「生物安全操作檯(BiologicalSafetyCabinet,BSC)(classII)」進行，和一般的「化學抽氣櫃」或「無菌操作檯」不同。

化學抽氣櫃是負壓，避免化學物質滲透到外面空氣中；而無菌操作檯則是正壓，由外界吸入空氣，經由高效率過濾網(HEPA)過濾後，將乾淨的空氣送出，避免外在空氣微生物進入。

生物安全操作檯是內循環系統，由外界吸入並過濾的空氣，會在操作檯前後兩端被吸入，並不會流到外面，因此操作檯內外的空氣完全隔離。

這樣的好處在於除了可避免外界微生物進入汙染，同時也可以避免內部感染性生物(如病毒)暴露到外界。

而維持穩定的氣流需要控制拉門在特定高度，過高或高低皆會導致氣流不穩定，影響安全狀態。

比較舊型的生物安全操作檯沒有自動化系統，必須由人力判斷高度，通常會在拉門下緣貼上一張紙條，正確的高度會讓紙條水平浮起。

新型的操作檯會自動偵測，錯誤的高度會使系統發生警報聲，因此較容易判斷。

操作檯開始使用前，先以70%酒精擦拭平面，並讓風扇運轉5分鐘以上，使氣流穩定。

所有實驗用品都必須先以70%酒精擦拭過，才能放入操作檯裡面。

裡面物品的擺放不應過度壅擠而阻擋氣流的流動，如果有很多實驗，應該分階段移入物品，不要一次全部移入。

取用無菌溶液和操作細胞時，打開蓋子後應盡快蓋回，並且在開蓋過程中，盡量避免經過上方。

實驗完畢後，以70%酒精擦拭平面，並開啟UV照射半小時以上。

新型機器可設定時間，舊型需要手動關閉。

一些常用室溫物品可以放置於操作檯裡面，如自動吸量管、微量吸管、吸管(tip)、管子架子等，但要應避免塑膠類物品受UV長時間照射，造成塑膠老化(每次使用完照射半小時即可)。

注意氣流壓力，定期更換紫外線燈管和過濾網。

  細胞培養箱 細胞培養箱有完整的偵測功能，能夠精準地控制溫度和二氧化碳濃度，新型的培養箱甚至可以設定濕度，以及可以內部滅菌(記得要移走細胞和特定物品)。

如果無法控制濕度，則通常會放置水盤以維持足夠的溼度，避免培養液蒸發造成鹽類劇烈變化，影響細胞生長。

水盤應使用高壓滅菌過的二次水，並定期清洗更換。

平常使用時，要注意二氧化碳濃度、溫度及水盤是否有污染。

  水浴槽 細胞培養液通常儲存於4oC環境，保持培養液中營養成分，因此使用前必須回溫。

通常細胞培養溫度為37oC，因此會使用水浴槽加熱培養液至相同溫度，才開始進行實驗。

水浴槽使用一次水即可，並添加抗菌劑，延長使用使間。

使用時要注意，不要讓水平面低於加熱棒，以免發生危險。

切記要定期清洗，保持乾淨。

  二氧化碳鋼瓶和氮氣鋼瓶 若細胞培養基以碳酸鹽為pH緩衝系統，則需補充二氧化碳以達到緩衝作用，通常設定在5%，遠高於自然環境中的濃度，因此需要另外提供二氧化碳。

有些實驗因為特殊需求需要低氧環境(<20%)，此時會使用氮氣取代空氣，降低氧氣濃度。

兩種氣體使用的鋼瓶為了安全，必須固定於牆上，並且準備兩個，一個備用。

  細胞實驗用品無菌處理 通常購買的細胞培養皿和使用的溶液皆已經經過無菌處理，其他自行配置的物品必須先經過無菌處理，才能夠處理細胞。

無菌處理的方式有高壓蒸氣滅菌法(濕式滅菌)、乾熱滅菌(乾殺)及過濾除菌。

  高壓蒸氣滅菌法(濕式滅菌)： 使用高壓滅菌釜，在高壓飽和水蒸氣作用下，120oC作用15-20分鐘。

適用於耐高溫的容器及不會因高溫破壞成分的溶液。

  乾熱滅菌(乾殺)： 使用烘箱，170-180oC作用1-4小時。

適用於玻璃器皿(如玻璃吸管)，滅菌完即可使用，不需要等待烘乾時間。

  過濾除菌： 多數營養成分會因為高溫作用破壞活性，因此只能用過濾法滅菌。

使用0.22um孔徑的過濾膜，使用針筒連接推入液體，出口處即為無菌狀態。

作用原理在於0.22um孔徑小於病原體，因此可以去除微生物。

需要注意，不同種類溶液要選擇不同過濾膜，實驗室常見的polyethersulfone(PES)可以過濾大部分的水溶液，但是千萬不能拿來過濾有機溶液。

  一般細胞培養： 了解細胞生長條件，以及能夠正確地保持無菌操作後，接下來進入到細胞培養。

細胞一般培養可分成三部分，解凍細胞、一般培養以及冷凍細胞，熟悉三個步驟的操作後，才能夠獨立操作細胞實驗。

  解凍細胞 細胞通常保存於液態氮裡，拿取細胞凍管時需要注意安全。

拿取前必須加熱水浴槽至37oC，並溫熱好細胞用培養液。

拿取細胞凍管後，應「迅速」放入水浴槽中，快速回溫。

如果於常溫回溫，微觀來看，細胞凍管最外層會先溶化，此時內部依然處於低溫，所以又會使外層溶液凝固，造成細胞溶液反覆凍溶，造成不可回復的損傷。

因此，需要以37oC快速回溫，降低細胞損傷。

通常細胞冷凍液含有高濃度DMSO，因此解凍細胞時至少要以培養液稀釋10倍，並且於隔天更換培養液。

為了避免DMSO殘留，也可以離心去除(300g3-5分鐘)，重新以培養液懸浮細胞。

由於細胞剛於特殊環境中回復，因此必須等待一至兩周的時間(中間需要繼代)，細胞生長和特性才會恢復正常，此時才能夠進行細胞實驗。

  一般培養 開始培養細胞，需要練習細胞一般的繼代、細胞計數和觀察細胞生長情形。

細胞繼代 細胞培養至高密度時，必須收集細胞更換至新的培養皿，即一般稱作「繼代」。

對於貼附型細胞而言，需要破壞細胞和培養皿之間的連結，通常使用trypsin-EDTA處理。

胰蛋白酶(trypsin)可以破壞細胞和培養皿之間的蛋白質連接，而EDTA則可以螯合Mg2+和Ca2+，這些二價離子為細胞之間連結蛋白的輔因子，因此trypsin-EDTA可以「切」下細胞。

去除掉舊的培養液後(通常使用吸引器suction)，由於培養液中的血清會抑制胰蛋白酶作用，因此會先以約培養液一半體積的PBS清洗細胞表面。

去除PBS後再加入約1/10培養液體積的trypsin-EDTA，於培養箱中反應數分鐘。

Trypsin-EDTA濃度常使用0.05%，視情況可以調整濃度，而時間常為1-10分鐘，視細胞種類而定。

新接觸的目標細胞建議每1-2分鐘拿出來，於顯微鏡下觀察，成功切下而懸浮的細胞會成圓形，前幾次確認好時間後，以後都固定的時間即可。

之後，加入適量的培養液中和trypsin-EDTA，並取部分細胞液至新的已加入新鮮培養液的培養皿中，搖晃使細胞均勻分布，可採取上下左右搖晃或是8字搖晃，切忌避免使用圓圈式搖晃，容易使細胞聚集在中間。

細胞繼代的比例依據細胞種類有所不同，新的目標細胞建議嘗試多種比例。

新的目標細胞建議進行細胞計數後，取一定的細胞數繼代。

一般來說，多數細胞三天大概增加為10倍，因此繼代數目為滿盤細胞數的1/10。

要注意的是，不同細胞的大小不同，造成滿盤細胞數有所差異，通常培養皿的廠商會提供滿盤細胞數，但是實際上要自己確認。

像是纖維母細胞可能細胞較大，因此滿盤細胞數可能較少。

大部分細胞對於trypsin-EDTA有一定的耐受性，但是若最後細胞液中trypsin-EDTA比例大於1/10，或是比較敏感的細胞，則需要先離心(300g5分鐘)去除上清液，再以培養液懸浮。

懸浮型細胞則直接吸取細胞溶液，以離心(300g5分鐘)去掉上清液後，以新鮮的培養液重新懸浮，再取適量的細胞繼代即可。

  細胞計數 剛接觸新的細胞，或是要進行細胞實驗時，會需要計算細胞濃度，可以使用傳統的血球計數器或是自動計數器。

自動計數器雖然方便快速，但是無法分辨死亡細胞和黏在一起的細胞，因此會有些微誤差。

血球計數器有兩個計算槽，每一個計算槽刻劃9個1mm2的正方形。

當放入10uL，蓋上蓋玻片時，液體的深度為0.1mm，因此每一個正方形體積為0.1mm3，即為10-4mL。

因此，使用肉眼計算一個正方形的細胞數，除以10-4mL(或乘以104/mL)，即可算出細胞濃度(/mL)。

實際上為了更加準確，通常會計算四個角落正方形的細胞數，取平均後再做計算。

另外，為了分辨活細胞，通常會加入trypanblue(0.4%TrypanBlueSolution(ACEBiolabs,CC1005))，此染劑只能通過死亡細胞的細胞膜，因此死細胞會和背景同顏色(藍)，活細胞則是中間澄清無色。

計算時，只計數活的細胞，最後記得要乘上稀釋倍率。

舉例來說，取20uL細胞液加入20uLtrypanblue，混合均勻後放入10uL，計算四格細胞數共100顆細胞，因此原本細胞液的濃度就是100÷4×104×2=5x105/mL。

要注意血球計數器和自動計數器都有限制細胞濃度，過濃的話要先以培養液或PBS稀釋，過稀的話則必須先離心細胞液，以較少體積的培養液懸浮以增加濃度。

  細胞生長情形 細胞於培養皿中生長的速率並非相同，分成延遲期(lagphase)、指數期(logphase)和穩定期(stationaryphase)。

細胞剛種下時，會需要重新分細胞外基質、修復胰蛋白酶造成的損傷、重組細胞骨架、建立細胞之間連結等等，此階段生長較緩慢，稱為延遲期。

不同細胞需要的時間不同，數小時到兩天都有，要仔細觀察目標細胞的變化，一般來說是以細胞全部貼附當作基準。

接下來，細胞開始快速生長分裂，即進入指數期。

此階段的細胞最有活性，因此大部分的藥物測試實驗會在此階段進行。

最後，當培養液中的營養成分消耗殆盡，或是沒有細胞生長的空間(培養皿)，細胞就會進入穩定期。

大部分細胞停止分裂，時間一久，培養液中代謝物累積過多，會造成細胞死亡。

不同細胞的階段時間皆不相同，可以使用CCK-8CellCountingKit(ACEBiolabs,CC1007)測定細胞生長情形。

  冷凍細胞 有些細胞的處理花費時間較長(如製作穩定細胞株)或是花費較貴，或是純粹是增加實驗室細胞庫存，都需要冷凍細胞保存。

目標細胞應處於健康的狀態(不健康的細胞冷凍後還是不健康)，並且處於生長活躍期(8-9成滿)，千萬不要過滿導致細胞生長停頓(如果不小心過滿，則先行繼代，下一次再冷凍)。

冷凍細胞使用的保存液建議新鮮配置，通常使用培養用的培養液，添加5-10%DMSO，搭配30-50%FBS。

細胞濃度建議1-5x106cells/mL，一管1mL。

細胞冷凍用的管子被稱作「冷凍小管」，是內旋式蓋子，可以避免因為冷凍解凍造成的溫差而爆裂。

實際操作和一般培養步驟相同，取適量細胞離心(300g3-5分鐘)去掉上清後，以保存液懸浮細胞，分裝到冷凍小管中，放入「漸凍盒」，並放入-80oC，隔天移到液態氮裡。

注意細胞只能暫放-80oC，長期需要保存於液態氮中。

細胞冷凍的過程和解凍相反，需要足夠「緩慢」，「漸凍盒」的目的在於此。

「漸凍盒」通常會添加「異丙醇」，因為剛好異丙醇降溫速率約為每分鐘1度。

而在這個過程中，細胞外的水會先開始凝固，此時DMSO可以破壞水的結晶，使水結晶不會過大而破壞細胞膜。

同時，細胞內的水分會滲透到膜外，細胞失去水分而成扁平狀，所有代謝反應也將停止，進入休眠狀態。

要注意的是，異丙醇每使用約五次就要更換，因為即使是在低溫，冰箱中的水分也會進入異丙醇中，改變其濃度，造成降溫速率太快，差不多五次會到達極限，因此需要更換。

最後，細胞實驗需要注意很多事情，所以除非時間緊迫，否則建議安排足夠的時間，讓實驗者能有充分的時間處理細胞，千萬不要因為趕時間，導致汙染造成前功盡棄。

同時，細胞實驗也需要專心一致，實驗者需要注意自己的精神和身體狀態，保持良好心情進入細胞房。

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