利用溶菌蛋白酶進行結晶方法的探討__臺灣博碩士論文知識加值 ...

結果在各種養晶方法與條件中，溶菌蛋白酶最佳結晶溫度是室溫、最佳結晶pH ... 蒸氣擴散養晶法的優點則是操作容易、簡便、蛋白質晶體撈上X-ray收繞射數據也較容易操作、 ... 資料載入處理中... 跳到主要內容 臺灣博碩士論文加值系統 ::: 網站導覽| 首頁| 關於本站| 聯絡我們| 國圖首頁| 常見問題| 操作說明 English |FB專頁 |Mobile 免費會員 登入| 註冊 功能切換導覽列 (165.22.106.144)您好！臺灣時間：2022/09/0411:28 字體大小：       ::: 詳目顯示 recordfocus 第1筆/ 共1筆  /1頁 論文基本資料 摘要 外文摘要 目次 參考文獻 紙本論文 QRCode 本論文永久網址: 複製永久網址Twitter研究生:施惠玲研究生(外文):Hui-LingShih論文名稱:利用溶菌蛋白酶進行結晶方法的探討論文名稱(外文):Comparisonofdifferentcrystallizationtechniquestestingonlysozyme指導教授:段葉芳、陳銘凱指導教授(外文):YEH-FANGDUANN、Ming-KaiChern口試委員:徐駿森、蔡麗珠口試委員(外文):Chun-HuaHsu、LichuChi口試日期:2010-06-04學位類別:碩士校院名稱:國立臺北科技大學系所名稱:生物科技研究所學門:生命科學學門學類:生物科技學類論文種類:學術論文論文出版年:2010畢業學年度:98語文別:中文論文頁數:79中文關鍵詞:蛋白質結晶、高效能蛋白質養晶技術機器手臂系統外文關鍵詞:Proteincrystallization、High-throughputproteincrystallizationroboticsystems、Highsuccesscrystallizationscreen.相關次數: 被引用:0點閱:347評分:下載:0書目收藏:0 在結構生物學領域裡面得到蛋白質結晶，目前在蛋白質結晶學領域裡仍是一個很大的瓶頸，能突破此瓶頸就能得到好的結構。

本論文以溶菌蛋白酶(Lysozyme)作為養晶蛋白質，分別用座式、懸式、微批量三種不同長晶方法與不同養晶條件方式，來長晶並記錄比較其情況與差異。

結果在各種養晶方法與條件中，溶菌蛋白酶最佳結晶溫度是室溫、最佳結晶pH是Na(OAc)pH4.5與最佳長晶濃度為30mg/ml中。

在微批量養晶方法所需的蛋白質濃度最低，沉澱劑濃度也最低。

懸式與座式的結晶差異度很小(因兩者均為藉蒸氣擴散達到過飽和規則排列而結晶出來)。

微批量養晶方法的優點是用較低濃度蛋白質與沉澱劑即可養出晶體，若蛋白質容易沈澱或蛋白質無法濃縮至高濃度時，很適合此養晶方法。

蛋白質結晶長得太快晶體太小顆，微批量養晶法也是個不錯的改善方法。

蒸氣擴散養晶法的優點則是操作容易、簡便、蛋白質晶體撈上X-ray收繞射數據也較容易操作、長晶的速度較快，實驗有時間的限制性或蛋白質量充足時蒸氣擴散養晶法是個較好的選擇養晶方式。

Inthefieldofstructuralbiology,proteincrystallizationremainsabottleneck;therefore,itisimportanttobreakthroughthisprobleminordertosolveproteincrystallographicstructures.Inthisstudy,threedifferentcrystallizationtechniques,i.e.sitting,hangingandmicrobatch,anddifferentcrystallizationconditionswereappliedtocrystallizelysozymeandtheirresultswerecompared.Asaresult,thebestconditionforthelysozymecrystalisatroomtemperature,crystallizationreagentofNa(OAc),pH4.5andproteinconcentrationof30mg/ml.Therequiredconcentrationsofproteinandreagentswerelowestinthemicrobatchmethod.Ifproteiniseasytoprecipitateorisnotabletoconcentratetothehigherconcentration,microbatchwillbethebetterchoice.Inaddition,ifproteincrystalgrowstoofastoristoosmall,itisbettertousethemicrobatchmethod.Incontrast,therearenotmanydifferencesbetweenthehangingandsittingmethods,becausebotharevapourdiffusionmethods.Theadvantagesofvapourdiffusionareeasytosetup,convenientandeasytomountcrystalsontoX-raymachine.Also,crystallizationisfasterinthevapourdiffusiontechnique.Ifthereisatimeconstraintforexperimentorproteinamountisample,thevapourdiffusionmethodwillbeabettermethod. 目錄中文摘要..................................................................................................................i英文摘要..................................................................................................................ii誌謝..........................................................................................................................iv目錄..........................................................................................................................v表目錄.....................................................................................................................viii圖目錄.....................................................................................................................ix中英文縮寫對照表................................................................................................xi第一章緒論.........................................................................................................11.1溶菌蛋白酶(Lysozyme).......................................................................11.2蛋白質結晶...........................................................................................41.2.1影響蛋白質結構因素................................................................41.2.2影響蛋白質結晶的因素............................................................71.3養晶原理與結晶方法介紹...................................................................141.3.1結晶的過程................................................................................141.3.2蛋白質結晶方法介紹................................................................161.3.2.1懸式蒸氣擴散養晶方法(Hangingvapordiffusionmethod)..................................................................171.3.2.2座式蒸氣擴散養晶方法(Sittingvapordiffusionmethod)..................................................................181.3.2.3微批量養晶方法(Microbatchunderoilmethod)...................191.3.2.3.1微批量養晶方法用兩種不同比重的油................................191.3.2.3.2微批量養晶方法用單種比重的油........................................211.3.2.4毛細管逆擴散養晶方法(Capillarycounter-diffusionmethod)..................................................................221.3.2.5微透析養晶法(Microdialysismethods)..................................241.3.2.6微毛細管結晶系統養晶方法[Theplug-basednanovolumeMicrocapillaryProteinCrystallizationSystem(MPCS)]......................................................................261.4蛋白質機器養晶原理介紹....................................................................281.5X-ray結晶實驗簡易流程圖..................................................................291.6蛋白質結晶成功率統計分析.................................................................30第二章材料與方法.................................................................................................332.1實驗儀器................................................................................................332.2.1自動蛋白質養晶機器...........................................................................342.2蛋白質結晶觀察....................................................................................352.3實驗材料................................................................................................372.3.1耗材與相關藥品.......................................................................372.3.2實驗材料(蛋白質).................................................................392.4養晶操作方法的介紹............................................................................442.4.1懸式蒸氣擴散養晶方法(Hangingvapordiffusion)....................442-4.2座式蒸氣擴散養晶方法(Sittingvapordiffusion).....................452-4.3微批量養晶法(Microbatchunderoil)..........................................482.5實驗步驟.................................................................................................492.5.1溶菌蛋白酶最佳化結晶濃度.......................................................502.5.2溶菌蛋白酶主沉澱劑濃度變化....................................................502.5.3溶菌蛋白酶不同溫度變化............................................................502.5.4溶菌蛋白酶酮濃度不同主沉澱濟變化........................................512.5.5溶菌蛋白酶不同觀察時間............................................................512.5.6溶菌蛋白酶pH變化.....................................................................522.5.7溶菌蛋白酶比較不同96養晶條件在不同養晶方法裡蛋白質結晶造成的差異與結果...................................................522.5.8溶菌蛋白酶用相同96養晶條件在不同養晶方法對蛋白質結晶造成的差異與結果..........................................................532.5.9將溶菌蛋白酶晶體撈上X-ray收X-ray繞射圖.............................54第三章結果.............................................................................................................553.1蛋白質結晶品質的判定依據....................................................................553.2溶菌蛋白酶(Lysozyme)最佳化結晶濃度.................................................583.3主沈澱劑濃度變化....................................................................................593.4溫度變化....................................................................................................603.5同濃度不同主沈澱劑變化........................................................................613.6不同觀察時間............................................................................................633.7pH變化.......................................................................................................643.8比較不同96養晶條件在不同養晶方法裡蛋白質結晶造成的差異與結果...............................................................................................663.9相同96養晶條件不同養晶方法對蛋白質結晶造成的差異與結果.......................................................................................................693.9.1座式（Sitting）.............................................................................693.9.2懸式（Hanging）............................................................................703.9.3微批量(Microbatch)........................................................................713.10X-ray晶體繞射圖結果.............................................................................72第四章討論.............................................................................................................75參考文獻...................................................................................................................77表目錄表1.1影響蛋白質結晶幾個重要條件的濃度範圍................................................12表2.1不同96養晶篩選條件明細............................................................................40圖目錄圖1.1溶菌蛋白酶一級結構圖..............................................................................2圖1.2溶菌蛋白酶(lysozyme)蛋白質結構圖.........................................................3圖1.3dynamiclightscattering(DLS)...................................................................5圖1.4圖示說明瞭解蛋白質折疊狀態的NMRSpectroscopy方法.....................6圖1.5SDSPAGE圖...............................................................................................7圖1.6測試蛋白質養晶濃度試劑[Pre-CrystallizationTest(PCT)]....................8圖1.7影響蛋白質結晶的幾個重要條件..............................................................11圖1.8概要說明結晶的過程................................................................................15圖1.9圖解說明懸式蒸氣擴散的養晶方法.........................................................17圖1.10圖解說明座式蒸氣擴散養晶方法...........................................................18圖1.11微批量養晶法用兩種不同油(Microbatchunderoil)的圖解說明................................................................................................................20圖1.12微批量養晶法用單種油(Microbatchunderoil)的圖解說明................................................................................................................21圖1.13圖解說明毛細管逆擴散法(Capillarycounter-diffusionmethods)所使用的相關設備與實驗成果介紹.......................................................23圖1.14圖解說明微透析法(Microdialysis)的蛋白質養晶方法所使用的相關設備與實驗成果介紹.......................................................................24圖1.15圖解說明微毛細管蛋白質結晶系統MPCS(MicrocapillaryProteinCrystallizationSystem)養晶方法所使用的相關設備與實驗成果介紹.................................................................................................................26圖1.16TargetDB實驗結果所得的統計圖.............................................................31圖1.17TargetDB生物有機體的來源所佔分佈比例圖.........................................32圖2.1自動養晶機器(Gilson925PCWorkstationCrystallizationSystem)設備介紹.........................................................................................34圖2.2觀察蛋白質結晶時所用的顯微鏡與恆溫箱.................................................35圖2.3溶菌蛋白酶蛋白質純度SDS電泳圖............................................................40圖2.4圖解說明懸式蒸氣擴散養晶方法及其相關設備介紹.................................44圖2.5圖解說明座式蒸氣擴散養晶方法及其相關設備介紹..................................47圖2.6圖解說明自動養晶機器微批量(Microbatch)養晶方法及其相關設備介紹.....................................................................................................48圖3.1介紹各種不同好壞結晶相.............................................................................57圖3.2不同蛋白質濃度對蛋白質結晶的影響..........................................................58圖3.3不同沈澱劑濃度對蛋白質結晶造成的影響與差異......................................59圖3.4不同溫度對蛋白質結晶造成的影響與差異..................................................60圖3.5同濃度不同沈澱劑對蛋白質結晶造成的影響與差異..................................62圖3.6不同時間對蛋白質結晶造成的影響與差異..................................................63圖3.7不同pH對蛋白質結晶造成的影響與差異...................................................65圖3.8不同養晶方法對蛋白質結晶造成的差異.....................................................68圖3.9座式蒸氣擴散養晶方法第二天長出完整的晶體與放置50天後晶體依然保存完整的樣子.........................................................................69圖3.10懸式蒸氣擴散養晶方法第二天長出完整的晶體與放置50天後晶體長相差異比較...................................................................................70圖3.11微批量養晶法(Microbatch)同樣96養晶條件有3種不同現象結果產生.......................................................................................................71圖3.12溶菌蛋白酶晶體X-ray晶體繞射圖……....................................................72圖3.13溶菌蛋白酶大顆與小顆晶體的X-ray繞射圖比較.....................................73圖3.14溶菌蛋白酶晶體在不同pH下X-ray繞射圖結果........................................74 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