Gene Cloning | 如何將目標基因克隆到載體中(上) - ACE Biolabs

Gene Cloning | 如何將目標基因克隆到載體中(上) 2019/05 · 獲得「一團多樣的 DNA 片段混合物」：細菌、細胞或組織的染色體 · 聚合酶連鎖反應：「夾」出特定目標片段。

首頁 GeneCloning GeneCloning|如何將目標基因克隆到載體中(上)2019/05/03 GeneCloning   實驗室常常會聽到“cloning”這個詞，老師偶爾會請你“cloning”一段基因，到底“cloning”是什麼意思呢？Cloning指的是從一團多樣的DNA片段混合物中，挑選出特定的序列片段，黏接到「載體」上。

將「載體」送到研究目標中(如細菌和細胞)，並在目標中大量表現，來研究此特定序列對於目標的影響。

傳統上通常會使用聚合酶連鎖反應(polymerasechainreaction,PCR)，「夾」出特定目標片段，此步驟有時需要一定的運氣，需要嘗試不同的「夾子」和反應條件。

而近代科技的進步則推出另外一種方法——直接使用化學的方式全序列合成，不過此方法非常昂貴。

Cloning大致可以分成四步： 獲得「一團多樣的DNA片段混合物」：細菌、細胞或組織的染色體或cDNA。

聚合酶連鎖反應：「夾」出特定目標片段。

目標片段連接到「載體」上：分成純化目標片段和連接反應。

確認序列：放大含有目標片段的「載體」，以及送定序確認。

  一、獲得「一團多樣的DNA片段混合物」 此步驟為聚合酶連鎖反應的前置作業，必須先獲得含有目標片段的混合物。

可以是染色體DNA或是由RNA反轉錄形成的cDNA(complementaryDNA)，而抽取的來源可以是細菌、細胞或是動植物組織。

同一種DNA類型(染色體或cDNA)抽取原理差不多，不同來源可能會有些微差異，差異主要是破細胞的部分，比如說組織必須先均質化，去掉一些組織間質，而細菌有細胞壁，相比於細胞而言較難破壞。

現在為了方便科學家的研究，都有對應的套組。

最後得到的DNA在下個步驟中稱為「模板」，用來當作聚合酶連鎖反應的反應物。

破壞細胞的方式可分成物理法和化學法，化學法是直接使用lysisbuffer溶解細胞外層，物理法則有超音波、擠壓法、液態氮凍融法等。

之後抽取過程中，由於染色體DNA片段較長，因此需要小心避免斷裂。

傳統上，染色體DNA抽取時，會使用proteinaseK分解細胞中蛋白質，再使用高鹽溶液沉澱蛋白質，透過離心去掉雜質，最後使用異丙醇沉澱出DNA。

需要特別注意的是，染色體DNA因為分子量巨大，所以在回溶時需要提高溫度或是延長時間，建議55oC一小時或室溫過夜。

而ACEBiolabs也有提供管柱的方法(ACExtractDNAIsolationKit(fromCell/Tissue,ACEBiolabsCE1006)，可以節省沉澱和回溶的時間。

為了確認染色體DNA的完整性，會使用瓊脂糖膠體電泳確認(請見下方「二.聚合酶連鎖反應：「夾」出特定目標片段——E.聚合酶連鎖反應確認」)，樣本應該要位於10kb以上，並且沒有明顯的小片段脫尾。

而RNA雖然是多條小片段，但RNA本身較脆弱容易降解，所以實驗中需要保持乾淨。

傳統上，RNA抽取是使用有機溶劑變性蛋白質，透過離心分成有機層和水層，DNA和蛋白質會留在有機層，而RNA則在水層，最後使用異丙醇沉澱出RNA。

而ACEBiolabs也有提供管柱的方法(ACExtractTotalRNAExtractionReagent,ACEBiolabsCE1003)，可以節省沉澱和回溶的時間，以及增加安全性和避免有機溶劑汙染。

為了確認RNA的完整性(沒有降解)，會使用瓊脂糖膠體電泳確認(請見下方「二.聚合酶連鎖反應：「夾」出特定目標片段——E.聚合酶連鎖反應確認」)，主要是看在RNA中最多的核醣體RNA(rRNA)，都會有三條明顯訊號(真核是5/18/28S，細菌是5/16/23S)。

如果是使用有機溶劑抽取的話，還要特別注意260/230吸光值比例必須要大於2，小於2則代表有機溶劑汙染，會影響後續的反應。

純化的RNA還需要經過反轉錄成cDNA，可以大幅度地增加保存的穩定性，ACEBiolabs提供5XACEScriptII1ststrandcDNARTSuperMix(+gDNAwiper)(ACEBiolabs,EP2015)。

  二、聚合酶連鎖反應：「夾」出特定目標片段 聚合酶連鎖反應的起源： 聚合酶連鎖反應可以說是cloning中最重要的步驟，也是生物裡非常特別的機制。

大自然中幾乎所有生物的遺傳物質都是DNA，而生物能夠一代代地繁衍的其中一個關鍵就是「傳遞遺傳物質」。

經過科學家們的努力研究，才發現DNA複製的機制為「半保留複製」。

DNA為雙股結構，透過鹼基配對的方式(ATCG)形成氫鍵穩定結構。

DNA複製時，雙股分開來，兩股都當作模板，透過鹼基配對的方式接上新的鹼基，做出配對股(complementarystrand)。

新形成的兩條雙股DNA都同時有一股舊的和一股新的DNA，因此稱作「半保留複製」。

實際上細胞內DNA複製非常複雜，需要多種酵素的參與，而科學家們就是將這個反應搬到試管內，盡量地減少酵素的使用，而使用其他方式代替。

其中最重要並且無可替代的就是聚合酶(DNApolymerase)，負責辨認和配對鹼基。

聚合酶反應中還需要引子、dNTP和Mg2+以及適合的反應鹽離子液。

dNTP就是四種鹼基的合稱，提供複製時的原料和能量，Mg2+則是聚合酶的輔因子，幫助穩定DNA結構。

  聚合酶連鎖反應中的引子： 最關鍵的就是引子，引子為反應時的定位點，聚合酶會先辨認到引子，往下進行反應，因此可以透過設計引子序列「夾出」目標片段。

引子其實就是短片段的DNA，會設計成和配對股完全相同的序列。

由於聚合酶反應有順序性，做出來的配對股必須由DNA5’端到3’端，因此加入符合目標片段前後序列的引子，再加上限縮反應的時間，可以順利地放大目標片段。

網路上有很多免費的引子設計軟體，可以自己調整長度、GCcontent、Tm、self-annealing、pair-annealing。

長度：20-30b.p.，過短的話專一性太低，過長的話容易形成二級結構。

GCcontent：ATCG四個鹼基中，A和T配對，C和G配對，而前者的氫鍵鍵結較弱，後者較強，因此引子中的GCcontent越高，鍵結性則越強，一般建議40-60%。

Tm：此為50%引子和DNA黏合時的溫度，由長度和序列決定，長度越長，GCcontent越高，則Tm越高，建議55-65oC。

Self-annealing：引子自己形成二級結構的參數，分數越高代表引子會自己「捲」在一起，而無法有效地黏合模板DNA。

軟體上通常會有建議的閾值，只要低於閾值即可。

Pair-annealing：為兩個引子互相配對的參數，分數越高代表引子之間會「捲」在一起，形成「primerdimer」，而無法有效地黏合模板DNA。

軟體上通常會有建議的閾值，只要低於閾值即可。

其他：引子3’端最好是C/G，使得聚合酶一開始的反應較為穩定。

引子的好壞除了本身的特性之外，最重要的是專一性，假設引子長度為30b.p.，代表其專一性應該為(1/4)^30。

但是實際上由於模板DNA非常龐大，加上裡面的反應並不像預期地如此簡單，這些分子很容易發生交互作用。

因此，有時候需要試驗多組引子才能成功放大出目標片段。

  聚合酶連鎖反應溫度和時間： 除了上述材料之外，還需要三步驟溫度的改變：變性denaturation、黏合annealing、擴增extension，而以舊的模板做出來的配對股又可以在下一次反應中當作模板，因此透過三個步驟的不斷循環，可以指數地放大出目標片段，所以稱作「連鎖反應」(圖一)。

通常循環數會設在25-35個循環，過少的話放大的目標片段太少，過多的話容易出現非專一性訊號。

初始變性階段：95oC5-10分鐘 25-35個循環：變形95oC30秒、黏合55-65oC30秒、擴增72oC 最終擴增階段：72oC5-10分鐘 變性：透過加熱95oC的方式取代酵素，打開DNA雙股螺旋。

這步驟也是科學家們困擾的步驟，因為大部分的酵素在這個溫度都會永久地失去活性，使得以前必須在每一個循環的變性階段完後，再加入聚合酶。

直到後來科學家們發現生活在50-80oC的嗜熱菌，它的聚合酶可以耐高溫保持活性，才大幅地降低科學家們的麻煩。

為了完全變性，一開始會先變性5-10分鐘，之後的循環中只要30秒就足夠了。

黏合：引子黏合到模板DNA上目標片段的前後位置，溫度通常設定在低於Tm1-2度，但是由於實際上最適合的溫度會因為緩衝液成分(Mg2+,NaCl濃度)有所差別，建議第一次做時，測試不同黏合溫度。

擴增：此為聚合酶作用的步驟，設定最適合酵素的作用溫度，通常是72oC，作用時間是根據聚合酶的效率和目標片段長度，而聚合酶的效率是每分鐘作用1-2kb，根據廠商說明設定。

在循環結束後，最後會再72oC作用5-10分鐘，使擴增反應完全。

早期只能透過不同的水浴槽，手動改變反應溫度。

後來才設計出自動控溫的機器(PCRmachine)，可以設定各種程式，多塊控溫晶片的設計使得我們可以一次試驗不同的黏合溫度，就連升降溫的速率都可以控制。

而有時因為目標片段過長，而有較長的反應時間，機器也可以設定在4oC方便保存。

目前市面上販售的聚合酶試劑中通常有聚合酶、反應液(2-10倍)、Mg2+、dNTP，有些廠商會將Mg2+併到反應液中，節省操作步驟。

而DNA模板和引子由實驗者自己準備，DNA引子需要請其他廠商合成。

操作時要注意，聚合酶是生物酵素，需要低溫取用(通常於-20oC保存時為液體，可直接取用)；而dNTP容易因為反覆凍融失去活性，可於第一次使用時分裝。

ACEBiolabs提供的ACESuper-FidelityDNAPCRkit(ACEBiolabs,EP1005)，具有高效率、高連續性以及校正的能力，可以更快更精確地放大出目標片段。

圖一：聚合酶連鎖反應示意圖，第一次做出來的配對股可以在第二次反應中當作模板，再製作出配對股。

  聚合酶特性 聚合酶有四大特性，專一性(specificity)、熱穩定性(thermostability)、正確性(fidelity)和連續性(processivity)。

專一性(specificity)： 聚合酶的專一性決定於酵素本身和環境溫度，酵素本身的構形會專一性地配對鹼基，而環境溫度則決定酵素活性和構形。

酵素都有最適合作用的溫度，即使處在其他溫度，聚合酶依然有一定的活性，但是卻會導致專一性大幅度下降，而錯誤地放大出非目標片段。

最簡單的解決方法是冰上操作，在機器溫度到達變性溫度前，配好的反應液必須置於冰上，降低酵素活性。

另一個方法則是“hotstart”，加入特殊的抗體抑制聚合酶，只有當溫度超過90oC時，抗體才會失活及降解，聚合酶才能作用，大幅度地提高專一性。

熱穩定性(thermostability)： 就如同上述所提過的，在變性高溫下，一般的生物酵素都會永久地失去活性，直到後來科學家們發現了熱嗜菌，這種生物的酵素適合溫度位於50-80oC，並且可以耐受高溫而保持活性。

正確性(fidelity) 聚合酶除了透過蛋白質構形來決定下一個鹼基，還有另外一個機制可以提高正確性。

聚合酶除了有「5’到3’複製DNA」的能力之外，還有「3’到5’剪切DNA(3’to5’exonuclease外切酶)」的特殊能力。

酵素會「檢查」做過的部分，發現錯誤後就會停頓，去除掉錯誤的部分，再重新黏上正確的鹼基，這項能力也被稱作「proofreading」。

聚合酶配對鹼基的錯誤率大約是1/10^5，也就是每100,000鹼基中會有一個錯誤，而proofreading的特性可以降低100倍，使錯誤率下降至1/10^7。

連續性(processivity) 連續性的意思是代表聚合酶一次作用的連續長度。

在生物體內，聚合酶在DNA上移動時，有其他多種蛋白質協助「聚合酶—DNA」異構物的穩定。

而在試管內反應時，缺乏那些蛋白質的幫忙，聚合酶很容易「鬆脫」，使得無法做出目標片段全長。

因此，如果目標片段較長，則必須選擇高連續性的聚合酶。

ACESuper-FidelityDNAPCRkit(ACEBiolabs,EP1005)即可用來針對長片段目標，並且能夠抵抗常見的抑制物(heparin,xylan,humicacid等)。

  聚合酶連鎖反應確認 完成聚合酶連鎖反應後，通常會使用瓊脂糖膠體電泳(agarosegelelectrophoresis)分析。

瓊脂糖膠體電泳是用來分析大分子核酸(DNA和RNA)的方法。

瓊脂糖是由石花菜屬和江蘺屬藻類中萃取出來的多糖類，於室溫時不溶於水，必須透過加熱到90-95oC才能溶解。

而在緩慢冷卻到室溫時，瓊脂糖會緩慢地形成有序的網狀結構。

而在製備膠體時，必須確認瓊脂糖白色粉末完全溶解，冷卻溶解的膠體至50-60oC後，倒入鑄膠槽，並快速地插入齒梳，待膠體冷卻後，即可留下樣本槽。

ACEBiolabs提供AgaroseLE(ACEBiolabsC3016)。

核酸本身帶負電，在電場作用下，會由負極往正極移動。

核酸長度越長，越不容易通過網子，移動地越慢，因此瓊脂糖膠體可以用來分離不同長度的核酸。

瓊脂糖濃度越大，網子間的距離越小，即膠體的孔隙越小，可以用來分離較小差別的核酸。

通常1%瓊脂糖膠體可以用來區分0.5-10k.b.核酸，解析度大約是300-1000b.p.，長度越長則需要較大的差異才能分辨出來。

而2%瓊脂糖膠體則用來區分100-1000b.p.以下核酸，解析度大約是50-100b.p.。

瓊脂糖膠體的解析極限就是100b.p.左右，即使提高濃度也無法有效增加，更小片段的長度需要用聚丙烯醯胺凝膠電泳(SDS-PAGE)才能分辨(需要特殊的緩衝液)。

配置膠體時需要特別注意不能使用二次水，而必須使用電泳緩衝液，以確保電泳環境一致。

而瓊脂糖膠體電泳使用的緩衝液可以使用TAE(Tris-acetate-EDTA)或TBE(Tris-borate-EDTA)，兩者都是緩衝液，只不過使用不同的酸配置(acetate或borate)。

TAE膠體中DNA回收率較高，而且價格比較便宜，並且可以配製成50倍稀釋使用；然而解析度較低，容易產熱。

TBE解析度較高，比較不容易產熱，但是價格較貴，而且由於boricacid容易沉澱，只能配成5倍溶液。

另外，還有三個東西要添加：DNA染劑、DNAloadingdye和DNAmarker。

DNA染劑： DNA分子本身沒有螢光特性，因此必須要加入DNA染劑，方便我們觀察DNA。

早期使用的EtBr是透過平板的結構嵌入DNA雙股螺旋，在紫外光激發下，EtBr分子和DNA作用後會放出強烈的橙紅色螢光。

但是也因為嵌入DNA的特性，使得EtBr具有高突變性和致癌性，使用時要特別注意。

近代研發的DNA安全染劑雖然價格較貴，但是大幅度地降低危險，並且使用藍光激發(黃綠色螢光)，也較為安全。

ACEBiolabs提供DNASafeviewDye(ACEBiolabsER1012)。

依據DNA染劑使用時機可分成內染和外染，外染指的是電泳完成後，將膠體浸泡到含有DNA染劑的二次水中(通常是1/1000-1/2000稀釋倍率)，等待約5-10分鐘，再取出膠體至二次水中「退染」。

要注意染缸和退染缸要定期更換，因為DNA染劑容易光解，而退染用的二次水會因為使用次數太多，而有太多的染劑使退染效果降低。

外染的優點在於製備膠體比較容易，染膠區和電泳區可以分開，最後不會有不均勻的螢光結果。

內染指的是製備瓊脂糖膠體時，就一起加入染劑(通常是1/10,000-1/20,000倍率稀釋)，因此形成的凝固膠體即含有DNA染劑。

進行電泳時，DNA染劑會附著在DNA上。

優點在於解析度較高和節省時間，但因為螢光染劑本身帶正電，會隨電場一起移動，因此會出現膠體上面較亮下面較暗的結果。

  DNAloadingdye(或稱作追蹤染劑)： 包含甘油(glycerol)、EDTA以及染劑(通常是bromophenolblue和xylenecyanol)。

甘油：由於DNA易溶於水，因此注入樣本時，DNA很容易擴散至樣本槽外，損失掉DNA樣本，而甘油可以使DNA溶液密度較大，沉降到樣本槽底部。

ETDA：為二價離子螯合劑，可以捉住Mg2+和Ca2+，而抑制核酸酶(nuclease)，避免DNA降解。

染劑：由於DNA本身沒有可見光，因此需要其他染劑判斷電泳的進度。

常使用藍色的bromophenolblue和藍綠色的xylenecyanol，兩者都和DNA一樣，會在電場作用下往正極移動，前者移動速率差不多等於300b.p.，而後者約為3k.b.。

因此，可用肉眼判斷電泳大致的進度，依據目標片段長度來決定終止時間。

如果目標長度介於500-1000b.p.，則要小心注意藍綠色條帶；如果1k.b.以上，則通常會讓藍綠色條帶跳海，需要較長的電泳時間。

目前市面上常見的濃度有10倍和6倍，也有其他染劑成分，基本上沒有優劣，視個人的使用習慣。

通常DNApolymerase試劑中就會附上(10xLoadingbuffer,ACEBiolabsEP1005-DD)，不需額外購買。

  DNAmarker： DNA電泳中，只能判斷長度的相對關係，無法了解絕對的長度，因此需要另外的標準。

而DNAmarker就像一把尺，提供數字大小的刻度。

裡頭包含不同長度的DNA，通常市面上有兩種，一種稱作「1kbmarker」，範圍250b.p.-10k.b.，主要搭配1k.b.以上的目標片段使用；另一種稱為「100b.p.marker」，範圍100b.p.-3k.b.，主要搭配100-1000b.p.目標片段使用。

除了依據目標片段長度，來決定使用的DNAmarker，同時也會搭配到瓊脂糖膠體的濃度，1%膠體搭配「1kbmarker」，可以分辨出1-10k.b.片段，1k.b.以下片段距離較近而無法分辨；而2%膠體搭配「100bpmarker」，才可以分辨出100-1000b.p.。

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