Gene Cloning | 如何將目標基因克隆到載體中(下) - ACE Biolabs

連接反應中的原件有 vector 和 insert，vector 為線形質體，經過酵素將環形處理成線形，包含質體所有的構造 (複製起始、抗生素、螢光等等)；而 insert 為 ... 首頁 GeneCloning GeneCloning|如何將目標基因克隆到載體中(下)2019/05/03 GeneCloning|如何將目標基因克隆到載體中(上)   三、目標片段連接到「載體」上：分成純化目標片段和連接反應。

純化目標片段DNA： 經由瓊脂糖膠體電泳確認後，必須要從膠體中純化出目標片段DNA。

這部分實驗都是使用市面上販售的套組完成，而純化的方法是透過管柱的吸附。

首先切下含有目標片段DNA的膠體，使用特殊溶劑，在55-65oC作用下溶解凝固的膠體。

透過管柱吸附住DNA，使用緩衝液清洗管柱中的DNA以去掉雜質和鹽類，最後再沖下DNA，基本上於一個小時之內完成。

  連接反應： 純化後的DNA通常會先接到特殊「載體」上，方便其他實驗操作。

通常使用的「載體」為質體，此為細菌天生的小型環形DNA，主要功能是對抗環境壓力和毒素。

這連接的反應即稱作連接反應(ligation)，而使用「質體」並不是環形，而是廠商做出來的線形質體，專門作為聚合酶連鎖反應後產物的連接反應。

連接反應中的原件有vector和insert，vector為線形質體，經過酵素將環形處理成線形，包含質體所有的構造(複製起始、抗生素、螢光等等)；而insert為短片段的目標基因。

除此之外，還需要連接酶(ligase)，以及反應所需要的鹽類溶液和提供能量的dNTP(通常會直接附成一管緩衝液)。

反應的溫度和時間按照廠商建議，通常是15-25oC反應1-2小時，可以延長時間以增加效率，也有人建議4oC反應過夜。

連接反應成功率決定因素是vector和insert的比例，insert的莫耳數要大於vector，以增加碰撞機率。

根據科學家們過去實驗的經驗，通常比例為一莫耳的vector配上3-5莫耳的inert，提供vector的廠商會有建議比例。

計算莫耳數會需要重量和分子量[重量(g)除以分子量(g/mol)即為莫耳數]，分子量可用長度乘以平均鹼基對的分子量(700g/mol)估算，或是由vector/insert長度比例計算即可。

也就是同樣重量的vector/insert莫耳數比為長度的倒數比。

而重量的話由於一般常使用測定核酸濃度的Nanodrop經常會高估，所以建議由電泳結果確認。

DNAmarker中不只提供不同長度的DNA片段，同時也註明了各個片段的濃度，因此經由比對聚合酶連鎖反應結果的目標片段，可以大致判斷出重量。

最好的做法是從瓊脂糖膠體純化出DNA後，取少量再進行一次電泳，比對DNAmarker來得知濃度。

但是，由於目的在於連接反應的成功，而不需要最高效率，因此也可以純化效率6-8成來估算濃度。

又或者可以一次嘗試多種比例，避免估算錯誤而導致連接反應失敗。

連接反應中選擇的vector和聚合酶的特性息息相關。

DNA片段的末端有分成黏滯端(sticky/cohesiveend)和平滑端(bluntend)，前者表示末端的雙股並不等長，而有其中一股較長，後者則是雙股等長。

某些聚合酶進行反應時，會在末端的3’加上一個adenine鹼基(A)，使得最終產物會在兩端的3’多一個鹼基，因此必須選擇在兩端5’帶有thymine鹼基(T)的vector(市面上稱作TAvector)。

黏滯端的連接反應效率通常比平滑端高許多，平滑端的連接反應需要較多的連接酶和延長反應時間，有些廠商會提供PEG(polyethyleneglycol)(最終濃度5%)，用來提高效率。

四、確認序列：放大含有目標片段的「載體」，以及送定序確認。

連接反應後的質體必須先放大處理，才有足夠的當量送定序。

一般會使用細菌作為放大質體的宿主，因此vector包含細菌內的複製起始和抗生素篩選基因。

將質體送進細菌的過程稱作「轉形transform」，轉形其實是細菌天生的特殊機制。

最早研究發現，將經過煮沸殺菌的含有抗藥性的細菌，和沒有抗藥性的細菌一起培養，則可以得到有抗藥性的細菌。

後來發現抗藥性基因存在於質體上，並且細菌天生具有吞噬外來DNA的能力，因此可以獲得抗藥性。

只不過這樣的能力很弱，不足以讓我們完成實驗。

因此，後來發展出利用電流或是化學短暫且些微地破壞細胞膜，增加細胞膜的通透性，使質體更容易進入細菌。

製作出來的細菌即稱作「勝任細胞competentcell」，可以自己在實驗室製作，或是向廠商購買。

比較常用的是化學的方式，只需要冰塊和水浴槽即可操作。

步驟可分成四步，冰上平衡、熱刺激(heatshock)、冰上休息以及回復(recovery)。

冰上平衡為質體和勝任細胞的混合，前者溶液體積不得超過1/10，以免破壞勝任細胞周遭的化學環境，時間為5-10分鐘。

再來是透過熱增加細胞膜通透性，通常是42oC30-60秒，此步驟要精準測量時間，時間過長會破壞細菌，導致轉形失敗。

冰上休息3-5分鐘可以穩定細菌的細胞膜。

回復則是加入營養液(LB或SOB)，讓細菌能夠修復一些損傷，以及表現抗生素抗性基因。

回復條件為37oC1-4小時，實際時間要看勝任細胞的能力以及抗生素機制，常用的有ampicillin,kanamycin和chloramphenicol，後兩者機制是抑制蛋白質合成，對於細菌的損傷較大，需要較長的回復時間；而ampicillin則是抑制細胞壁合成，對於細菌本身損傷很小，我們自己的實驗發現完全不需要回復。

轉形完成後要將菌液塗到瓊脂盤(agarplate)上，瓊脂盤需要事先製備，並加入質體使用的抗生素。

塗盤完的瓊脂盤放到37oC中培養過夜，預期會看到一顆顆菌落，理論上每顆菌落都是由一顆細菌長成，所以稱做單一菌落(singlecolony)。

單一菌落擁有的質體會全部相同，因此可用來做後續的定序分析。

另外，為了分辨或去除出vector本身自己發生的連接反應，因此大部分的聚合酶連鎖反應用的線形質體都有經過特殊設計，在insert接進去的位置上放上特殊的酵素，若inert成功接入，則會破壞酵素活性。

常見的有兩種，第一種是 beta-galactosidase，可以分解X-gal(5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside)，形成藍色沉澱。

因此inert接入反應成功的菌落呈現白色，反之則為藍色，此方法被稱作「藍白篩」，可以分辨出成功和失敗的菌落。

另一種則是放入致死基因，失敗的菌落就會死亡，只有成功的得以存活，因此最後出現的菌落皆攜帶成功的質體。

最後就是質體上目標基因的序列確認，可以直接送件菌落本身，或是少量質體抽取後送件。

基本上都是交由外面廠商進行，需要注意的是要符合廠商要求的濃度和體積。

由於是使用「Sanger定序法」，此為終止的聚合酶連鎖反應，透過加入特殊的帶螢光鹼基，得到不同長度的片段，再透過電泳分離，以不同螢光確認鹼基，因此還必須加入一條引子做反應(一管一條引子)。

廠商通常會傳回兩個檔案，一個是文字檔，方便客戶直接拿來和目標基因的序列比對；另一個檔案為直接螢光結果，可以用來確認定序的可信度，通常可信度只有500-800b.p.，因此長度較長的目標基因需要以不同引子定序送件，通過交叉比對才能完全確認。

若定序結果顯示完全相同，則表示cloning順利完成，之後可能還會因為不同需求進行「subcloning」，將目標基因「移動」到其他質體上，此部分將會在其他文章中仔細說明。

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