基因治療- 二十一世紀的醫療新科技

病毒載體的優點在於其轉殖效率佳，表現可能較好，而缺點卻在於其潛在性的危險。

非病毒載體方法就恰好相反。

雖然其安全性較高，比較沒有副作用，但其轉殖效率及表現基因 ... April2000 No.1  生物技術專輯 　      基因治療 -二十一世紀的醫療新科技 　 台大醫院肝炎研究中心   黃麗華 　         ▲目錄 　 　 　    自1990年，第一例利用基因治療 方法治療人類疾病的臨床試驗開始，至今已滿十年的光陰。

在這十年當中，基因治療的技術一直不斷在更新，而其應用的疾病範圍，也由原始的遺傳性疾病不斷擴增至癌症、感染性疾病、心臟血管疾病等。

截至目前為止，在美國，已有 300多個臨床試驗 分別在不同的醫學中心進行。

而這些快速進步的生物技術，是否真的在臨床上為病人帶來一線新的曙光呢？很可惜的是，其成效目前好像並沒有很明確的結論。

而從臨床上得到更多的結論則是目前基因轉殖技術及基因表現方面，仍有待更進一步的改善。

在本篇文章裏，我將簡述一些基因治療所用的方法及其優缺點，並敘述基因療法應用在各種疾病的原理。

最後我將分析一下目前基因療法的極限及未來的方向。

基因治療所用的方法 目前用於基因療法的方法不外乎是藉由 反轉錄病毒載體 (retroviralvector)，腺病毒載體(adenoviralvecter)，腺衛星病毒載體 (adeno-associatedviralvector)，或微脂粒(liposome) 來攜帶基因，或直接將DNA 打入肌肉內。

病毒載體的優點在於其轉殖效率佳，表現可能較好，而缺點卻在於其潛在性的危險。

非病毒載體方法就恰好相反。

雖然其安全性較高，比較沒有副作用，但其轉殖效率及表現基因方面可能都有很大的限制。

(a) 反轉錄病毒載體：這是目前使用最多的一種載體。

雖然它是一種 RNA病毒，但其生活史中會經過反轉錄脢的作用而形成DNA，並嵌入宿主染色體中。

故其優點在於可形成長效型 (long-term) 的基因存在及表現。

這個病毒載體只能感染分裂的細胞，故鮮能直接用在活體內 (invivo)，且不能應用到不分裂的組織或細胞上。

一般使用反轉錄病毒載體時，可將細胞拿到體外，經由載體轉殖基因後，再將細胞送回活體內，這種做法稱為 exvivo。

這個病毒力價偏低，主要在於其無法耐受體外離心濃縮等步驟。

然而若將 vesicularstomatitisvirus(VSV) 之套膜蛋白取代反轉錄病毒自己的套膜蛋白，形成所謂的 pseudo-typedretroviruses；則病毒顆粒變為穩定，可經離心濃縮，大大增加病毒力價，就可應用在 invivo。

針對不能感染不分裂細胞的部分，目前也由愛滋病毒載體 (HIVvector)的改良與使用，而可進行非分裂細胞的感染。

這些問題都解決後，目前最大的困難在於如何使帶入的基因表現受到適當的調控，這可能是最難的部份。

因為在遺傳性疾病的治療時，有些基因 (例如糖尿病人中胰島素) 的表現是需嚴格調控的。

分子生物學家必需找出最佳之調控序列，並適當地放入載體內，使所轉殖的基因的確能發揮如同正常細胞內的基因表現，的確是一項很大的挑戰。

  (b) 腺病毒載體： 這是個DNA 病毒，其力價可經離心濃縮而變得相當高，對分裂或不分裂的細胞均能感染，適合活體內使用，所以非常廣用。

腺病毒載體最大的問題在於引起強烈的免疫反應，造成病人有嚴重的發炎現象或副作用。

免疫反應也會清除病毒感染的細胞，造成基因表現都是非常短暫的。

雖然第二代、第三代的腺病毒載體已陸續問世，希望藉由剔除更多的病毒基因體部份以降低病毒蛋白所帶來的免疫現象，這種強烈的免疫作用似乎仍不容易免除。

前些時候，在美國臨床實驗時，即有一名 18歲青年因使用過高劑量之腺病毒載體用以治療ornithine transcarbamylase基因缺陷 的疾病，而導致強烈、急性的免疫反應，休克而死。

故在使用腺病毒載體時，如何拿捏有效的劑量與避免造成嚴重免疫反應的劑量中間，的確是一件不容易的事情。

故而腺病毒載體並不適合用來治療遺傳性疾病；但用在癌症上的治療和心臟血管疾病的治療，卻可能還是很適合的。

因為這些治療的目的都是希望殺掉腫瘤細胞、或增生的平滑肌細胞，短時效的基因表現較沒有關係;而引發適量的免疫反應，反而是有助於腫瘤細胞的清除。

至少目前為止，腺病毒載體用在癌症病人的臨床治療上，雖未見有明顯的治療成果，但至少尚未有任何毒性或不良作用的報導。

(c) 腺衛星病毒載體： 這是個相當小的DNA病毒，但卻綜合了反轉錄病毒的特性(會嵌入宿主染色體)，及腺病毒載體的特性 (會感染不分裂的細胞)，而成為目前遺傳性疾病基因療法的新寵。

在使用這個病毒載體時，基本上病毒本身的蛋白基因部份均已被剔除，故在宿主內也不會造成強烈的免疫反應，而可維持較長時段的基因表現。

而先前製備該病毒之步驟較繁瑣，且病毒力價偏低，目前也已一一克服，其力價也可高達 1010~1013cfu/mL，故非常適合用於活體內。

唯一較難克服的是：它是一個很小的 DNA病毒，故基因容量是很有限的。

(d) 微脂粒及DNA 肌肉注射：為避免病毒載體可能引起之危險性及副作用，有些學者利用微脂粒包裹 DNA，直接送入細胞或組織。

這種微脂粒可再加以改良，譬如帶有特異性抗體，或帶有一些配位體 (ligand)，則更可增加輸送DNA 至特定細胞之專一性。

然而目前微脂粒轉殖DNA 的效率並不高，且進去後的DNA多半在endosome 內即被分解，真正能進入到核內表現的DNA 很有限。

整體而言，藉由微脂粒法之基因治療成效有限。

微脂粒在血液內之穩定性也是一件值得考慮的事項。

但這些缺點將會逐一被克服。

 肌肉細胞有一特性，即會自動吞入 DNA。

因此有人利用注射方法，將DNA帶入肌肉細胞附近，DNA 即會被吞入，並加以表現。

雖然一般而言，它的表現量並不會很高，但卻足以引發很好的免疫反應。

甚且能造成很好的細胞性免疫反應，這對清除病毒或腫瘤細胞而言都是非常有用的。

故而最近利用 DNA 注射來引發預防性，甚且治療性的免疫作用，是一大熱門的研究方向。

 不管是上述那一種 DNA 轉殖方法，目前沒有那一樣是完美的。

尤其對於遺傳性疾病治療所需要之適當調控基因表現，更是難以達到。

而將來若要應用到臨床上一個組織器官，或一個實質腫瘤上的治療，基因轉殖效率及相對引起的副作用都是需要再進一步改善及審慎評估。

基因治療的應用 (a) 腫瘤治療：目前基因治療應用最廣的當屬腫瘤治療了。

有些研究是運用在治療方面，包括將調控免疫機能的一些細胞素 (cytokine) 基因送入腫瘤細胞內，做成腫瘤疫苗使用。

將腫瘤疫苗打入動物體內，希望引發宿主之免疫系統，重新認識腫瘤細胞的存在而自發性地將腫瘤清除。

還有一些其他之免疫調控分子，例如 HLA,B7,Flt-3L等都有人使用。

免疫治療最大的好處是可引起全身性及有記憶性的免疫作用，故對腫瘤轉移或復發，應有絕佳的清除或預防效果。

但相對的，對既以存在之大腫瘤，確有緩不濟急的感覺。

並且腫瘤的存在，常常會造成宿主之免疫力受到抑制的現象。

如此一來，要在癌症病人體內引發好的免疫反應，可能就非常困難了。

第二種方法是將自殺基因 (例如HSV-tk或cytosinedeaminase基因) 藉由載體送入腫瘤內，將腫瘤細胞殺死。

當然這種策略需要有很好的轉殖效率，使得較多的腫瘤細胞能得到自殺基因，才有辦法將之殺死。

第三種方法是使用一些抑癌基因。

因為大於 50%的腫瘤細胞可能都失去了野生型之p53，因此使用p53 可使得腫瘤變得較容易受放射療法或化學療法摧毀。

第四種方法則是利用轉殖抗血管生成因子 (anti-angiogenicfactors) 基因進入腫瘤內表現，所分泌出之因子會抑制腫瘤內血管內皮細胞的生長，進而阻礙血管的形成;間接地，腫瘤的生長也得以抑制了。

(b) 感染性疾病治療：對於病原 (細菌或病毒) 的感染，可以針對其重要的基因，利用基因轉殖的方法在感染處帶入一些因子，來抑制病原之基因轉錄或轉譯。

另外也可以殖入單鏈的抗體基因，來干擾病原蛋白的功能或包裹等。

這些做法，不外都是利用 DNA轉殖方法，來干擾病原菌的再生或傳播。

前述用DNA 肌肉注射方法，則是打入病原之關鍵基因，藉以直接引發預防性或治療性的免疫能力，來消除病原。

(c) 遺傳性疾病治療：若已知那個基因缺陷會引發那些遺傳性疾病，則理論上基因治療是可行的。

然而以目前基因轉殖的技術能力而言，只能針對單一基因所引起的疾病加以處理;若疾病的產生是由多個基因所造成，目前治療還是有些困難。

另外，我們也可以考慮來殖入一些補償性的基因產物，以改善其因缺乏該基因產物所引致的病症，但這些都還是需要去考慮它的調控問題。

(d) 心臟血管疾病治療：氣球血管造型術 (ballonangioplasty) 後，血管中之內皮細胞受到傷害，而平滑肌細胞卻反而因此而不斷增生，最後又重新造成血管壁增厚和動脈硬化的現象。

利用基因療法，科學家可以在氣球血管造型術的同時，帶入一些抑制平滑肌細胞生長 (如HSV-tk/GCV或Rb基因)或保護內皮細胞之一些相關基因(如 eNOS,VEGF)，因而可達到治療心臟血管疾病的目的。

未來的展望 目前基因治療最多用於癌症治療。

尤其針對癌症末期病人做為試療對象。

這些試療結果除了告訴我們各類載體的安全性之外，對於基因治療的成效，實在很難有什麼結論。

不過倒是提供了科學家一些重要訊息，尤以人體內的反應及小老鼠中的測試結果很不相同的觀點來看，腫瘤的治療似乎不是想像中的那麼容易。

在臨床上，我們會看到的癌症病人，可能腫瘤多半已經長到某種程度。

而且病人體內多半也有免疫抑制的現象。

我們期望用單一的免疫基因療法來治療幾乎是行不通的，這種現象在小老鼠的模式中已是不存在的。

故未來，基因治療的策略應採合併治療的方法，或者與傳統的治療方法合併，如手術開刀、放射線療法、化學療法，或者是合併使用多種應用不同原理的基因療法策略，希望能較有效的解決癌症的問題。

同樣的，基因治療用在遺傳性疾病最大的問題，在於如何提供一個終身性的治療。

因為幹細胞 (stem cells) 是生成組織細胞之主要來源，如何讓載體順利進入幹細胞，並適當的表現出來，是未來分子生物學家應該努力的重點。

另外如何設計出一個好的載體，使得對各種器官的疾病，都能提供很好的轉殖效率，且不致有很強的副作用，也是大家應努力的方向。

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